重金属镉(Cd)因其污染性强、污染范围广而受到广泛关注。Cd在植物体内积累到一定程度后会抑制光合作用和呼吸作用，甚至导致生物量下降或死亡^[1]。水稻是Cd积累能力最强的粮食作物，土壤中的Cd可以通过根系吸收转运到叶片和穗轴中，大气沉降中的Cd也可以通过叶片进入植物体内，在籽粒灌浆期间转运到稻米中^[2-3]。稻米中的Cd通过食物链进入人体，危害人体健康^[4]。

锌(Zn)是许多蛋白质和酶的重要组成部分，对植物的生长发育起着至关重要的作用^[5-6]。研究表明，Zn与Cd会竞争相同载体蛋白进行跨膜运输^[7]。加Zn可使水稻、烟草、小麦对Cd的吸收减弱，说明Zn对植物吸收Cd可能存在拮抗作用^[8]。施Zn能促进小麦的光合作用，使POD酶活性提高，质膜稳定性增强，还降低了小麦体内脯氨酸的含量，进而加强了小麦对Cd胁迫的抵御能力^[9]。此外，Zn可以通过缓解DNA损伤、调控脯氨酸及多胺代谢来降低Cd对植物的毒害^[10]。土壤中Zn和Cd之间也存在交互作用。土壤中添加Cd会使Zn的吸附量下降、吸附速率减慢^[11]。Zn能与吸附在土壤胶体上的Zn进行离子交换，降低土壤中Zn的有效性，增加土壤中可溶性Zn的含量。随着土壤中Zn浓度的增加，Zn与Cd在配合物上发生显著的竞争吸附，使得土壤中有效态Cd显著增加^[12]。

硅(Si)是土壤中第二大元素，植物可以在茎叶中积累丰富的Si。Si能提高植物生长发育过程中抵抗各种生物和非生物胁迫的能力^[13]。水稻是一种高积累Si的植物^[14]。Si在质外体与Cd形成沉淀是缓解植物体内重金属毒害的主要原因^[15]。Si和Cd在一些代谢不活跃的组织尤其是中柱鞘、木质部和韧皮部细胞壁内皮层形成的Si-Cd沉淀也可以抑制Cd的吸收和转运^[16]。Si还能将更多的Cd分隔在液泡中或固定在节间^[17-18]，从而减少Cd在水稻中的移动。这些结果表明，施加Si能通过影响Cd在植物体内的吸收转运来减缓Cd的毒害作用。

虽然一定浓度的Si和Zn都能抑制水稻对Cd的吸收转运，但未见Si-Zn互作方式与水稻Cd吸收转运关系的研究报道。本文以水稻幼苗为材料，通过在根际环境中施加不同浓度的巯基硅和Zn，对水稻幼苗Cd的亚细胞分布特征、必需元素、可溶性蛋白进行研究，探讨了根际环境中添加Si和Zn离子抑制水稻Cd吸收转运的互作机理，从而为降Cd复合肥料的研发提供参考依据。

1 材料与方法

以湘早籼24(X24)为供试材料，选用饱满均一的水稻种子，在300 mL 5%的NaClO中浸泡30 min，用去离子水反复冲洗以去除残余的NaClO。水稻种子冲洗干净后均匀放入装有少量水的育苗盘内，放入28 ℃恒温培养箱黑暗培养72 h后移入人工气候室。待水稻长到两叶一心时，选取均一的水稻幼苗移到装有8 L 1/10Hoagland营养液的塑料盆(35 cm×25 cm×12 cm)中进行培养。塑料盆上盖有带小圆孔的硬塑料板，将幼苗用海绵固定在小圆孔内。待水稻长到三叶一心时挑选长势一致的幼苗，在去离子水中饥饿1 d，然后放置于以1/10 Hoagland营养液为基础的不同处理液中处理7 d。水培试验整个过程在人工气候室中进行，昼夜时间为16 h/8 h，昼夜温度为25 ℃/20 ℃，白天光照为105 μmol·m^-2·s^-1、相对湿度为60%^[19]。

1.1 培养与处理方法

设置处理液镉(CdCl₂)浓度2.7 μmol·L^-1，巯基硅浓度为0.05(Si1)、0.1(Si2) mmol·L^-1，Zn浓度(ZnSO₄·7H₂O)分别为0、0.2 mmol·L^-1。巯基硅来自深圳百乐宝生物农业科技有限公司，硅含量≥30%，溶解度为75%，明显优于硅酸钠(NaSiO₃·H₂O)的溶解度36.1%。处理液用HCl和NaOH调节pH至5.5~6。每个处理3次重复。

1.2 样品采集与处理

将处理好的水稻幼苗根系用5 mmol·L^-1的CaCl₂浸泡10 min^[20]，以吸附去除根系表面的Cd²⁺，之后用去离子水冲洗干净，用吸水纸吸干表面水分，用剪刀将地上部与根系分开。一部分放入信封，75 ℃恒温烘干，用于全Cd测定；另一部分，分别称取根系和地上部鲜样1 g，用锡纸包裹后放入液氮中冷冻，之后置于-80 ℃储存，用于亚细胞测定。

1.3 Cd、Si含量的测定

用剪刀将恒重的样品剪碎，称重后置于消煮管中，加入7 mL HNO₃过夜，用消解仪ED54于110 ℃加热2.5 h，冷却后加入1 mL的H₂O₂，盖盖加热1.5 h，170 ℃开盖赶酸至0.5 mL左右，定容至25 mL，用原子吸收仪(AAS，ZEEnit70d0，Analytikjena，德国)测定样品中Cd含量^[21]。

分别吸取Si标液0、0.125、0.25、0.5、1.25、2.5、5 mL定容至50 mL，Si含量分别为0、2.5、5.0、10、25、40、50 μg·mL^-1。向10 mL离心管中依次加入2.7 mL去离子水、200 μL Si标液、1.5 mL 0.26 mol·L^-1 HCl、200 μL 10%钼酸铵，静止5 min后再加入200 μL 20%酒石酸、200 μL 2%抗坏血酸摇匀静止25 min。样品采用高压灭菌法处理后依次加入药品，600 nm处比色^[22]。

1.4 亚细胞组分的测定

将冷冻的水稻幼苗放在含有50 mol·L^-1 Hanks平衡盐溶液(HEPES)、500 mol·L^-1蔗糖溶液、1 mol·L^-1二流苏糖醇(DDT)、5 mmol·L^-1抗坏血酸和1%(W/V)聚乙烯吡咯烷酮(PVPP)的提取缓冲液中匀浆，并用NaOH调pH至7.5。匀浆液通过尼龙布(100目)过滤，用缓冲液冲洗后100 g离心5 min，沉淀为细胞壁组分(F1)。上清液以10 000 g离心30 min，沉淀为细胞器组分(F2)，上清液为胞液组分(F3)。所有步骤均在4 ℃下进行^[23]。各组分烘干后按照1.3的步骤测定Cd含量。

1.5 可溶性蛋白的测定

称取45.6 g K₂HPO₄·3H₂O和27.2 g KH₂PO₄放入1 L容量瓶中摇匀，标为A液和B液。将153.8 mL A液和96.2 mL B液加去离子水定容至1 L，配制成pH为7的50 mmol·L^-1磷酸缓冲液。将227 mL A液和23 mL B液用去离子水定容至1 L，配制成pH为7.8的0.05 mmol·L^-1磷酸缓冲液。称取0.3 g EDTA-Na₂和5 g聚乙烯吡咯-K30溶于1 L pH为7的磷酸缓冲液，配制成粗酶提取液。

将新鲜水稻幼苗用去离子水清洗干净，然后各称取0.5 g左右。用液氮研磨，加入8 mL提取液，4 ℃ 10 000 r·min^-1离心20 min，取上清液待测。

1.6 数据处理与计算

Cd在水稻根系和地上部亚细胞组分中的分配比率(%)为各器官亚细胞组分中的Cd含量占各器官Cd总量的百分比。

采用Excel 2007、SPSS 11.5进行数据统计分析和作图。

2 结果与分析 2.1 Si-Zn互作对水稻幼苗Cd和Zn含量的影响

由图 1所示，施加Si和Zn对水稻根系和地上部Cd含量有显著影响。施加0.05 mmol·L^-1和0.1 mmol·L^-1巯基硅可使根系Cd积累量下降5.4%~34.6%(图 1A)。地上部Cd积累量分别下降3.5%和51.8%(图 1B)。同时添加0.2 mmol·L^-1 Zn和0.05 mmol·L^-1 Si或0.1 mmol·L^-1 Si使水稻幼苗根系中的Cd含量分别下降27.4%和68.9%，使地上部的Cd含量分别下降78.0%和88.0%。Si和Zn共存时对Cd的抑制效应明显大于单独施加巯基硅的抑制效应，对地上部Cd积累量的抑制效应大于对根系Cd的抑制效应。

单独添加巯基硅对水稻幼苗中的Zn含量没有显著影响。施加0.2 mmol·L^-1 Zn后，水稻幼苗根的Zn含量明显高于地上部，锌含量随着添加Zn浓度的增加而大幅升高。和对照相比，Si1+Zn和Si2+Zn处理使水稻根系中的Zn含量分别提高了19倍和14倍(图 1C)，使地上部中的Zn含量分别提高了10倍和6倍(图 1D)。

2.2 Si-Zn互作对水稻幼苗亚细胞组分中Cd含量及分配比例的影响

水稻根系细胞壁、细胞器和胞液组分中的Cd含量有显著差异。Cd在幼苗根系的亚细胞分布表现为细胞壁＞胞液＞细胞器(图 2A)，在地上部的亚细胞分布表现分别为细胞壁≈胞液≫细胞器(图 2B)。施加Si和Zn显著降低了水稻幼苗亚细胞各组分的Cd含量。其中细胞壁和胞液中的Cd含量下降幅度较大。

如图 2A所示，和Cd处理相比，Cd+Si1处理对根系细胞壁组分中的Cd含量无显著影响，Cd+Si2处理使根系细胞壁组分中的Cd下降了43.8%，但这2种处理使胞液组分中的Cd含量分别下降了38.7%和53.0%。Zn-Si互作显著抑制Cd进入胞液组分的过程。Cd+Si1+Zn和Cd+Si2+Zn处理使细胞壁组分中的Cd含量分别下降了39.2%和79.8%，使胞液组分中的Cd含量分别下降了43.9%和63.7%。Zn-Si互作显著抑制Cd进入细胞壁和胞液组分的过程。如图 2B所示，Cd+Si1和Cd+Si2处理使地上部细胞壁组分中的Cd含量分别降低了18.3%和56.4%，胞液组分中的Cd含量分别下降了14.8%和61.7%。Cd+Si1+Zn和Cd+ Si2+Zn处理使细胞壁中的Cd分别下降了87.2%和91.4%，使胞液中的Cd含量分别下降了95.3%和95.4%。Si-Zn互作对根系细胞壁中Cd积累的抑制作用较弱，对胞液中Cd的积累抑制作用较强。

在根际环境中添加Si和Zn对根系和地上部亚细胞组分中的Cd分配也产生了显著影响。随着Si浓度的增加，根系细胞壁中的Cd分配比例显著下降，和无Si的Cd处理相比，Cd+Si2和Cd+Si2+Zn处理使根系细胞壁中的Cd分配比例分别下降了10%和20.3% (图 3A)。而地上部Cd分配比例的下降主要表现在细胞液组分中，Cd+Si2、Cd+Si1+Zn和Cd+Si2+Zn处理使地上部细胞液中的Cd分配比例分别下降了24.4%、53.4%和51.9% (图 3B)。

2.3 Si-Zn互作对水稻幼苗必需元素含量的影响

在Cd胁迫环境中，增加0.05~0.1 mmol·L^-1的巯基硅，根系中的Ca、Fe含量都显著下降，Mn的含量显著增加(表 1)。和单施Si相比，同时添加Si和Zn时，根系中的K和Zn含量显著增加，而Ca和Mn含量则显著下降。Si-Zn共存时对水稻地上部的K、Fe和Zn含量有明显的促进作用。从转移因子来看，与单施Si相比，Si-Zn互作促进根系中Ca、Fe向地上部的转运，对K、Mn的转运有一定的抑制作用(表 2)。

2.4 Si和Zn对水稻根系和地上部可溶性蛋白的影响

与单独的Cd胁迫处理相比，添加0.05 mmol·L^-1和0.1 mmol·L^-1的巯基硅使根系中的可溶性蛋白含量分别上升14%和44%，Si和Zn共存时，根系中的可溶性蛋白含量可提高20%~45%(图 4A)。但地上部的可溶性蛋白含量在处理间没有显著差异(图 4B)。

3 讨论

Si是促进水稻生长发育、提高水稻抗逆能力的有益元素，Zn则是水稻生长发育所必需的微量元素，参与多种生命活动过程。增加根际环境中的Si或Zn离子浓度能有效缓解Cd对根系的生理毒害，促进根系和地上部的生长发育^{[8, 25-28]}。本研究发现，在含2.7 μmol·L^-1 Cd的营养液中添加低浓度的Si (0.05 mmol·L^-1)对水稻根系中的Cd积累量几乎没有影响，当巯基硅的浓度增加到0.1 mmol·L^-1时，水稻根系和地上部的Cd含量才会显著下降。但当Si和0.2 mmol·L^-1 Zn共存时，低浓度的巯基硅也能显著抑制水稻对Cd的吸收和转运。

植物在长期的进化过程中形成了多元的解毒机制，在重金属污染环境中，水稻能将大量的Cd固定在根系中^[29]，只有少部分Cd通过维管束组织向地上部转运。Si既能促进细胞壁的发育以及Cd与细胞壁中半纤维素的结合^[30]，又能和Cd形成难移动的化合物沉淀在细胞壁或液泡中^[31]，还能通过降低蒸腾作用抑制Cd从根系向地上部的转运^[32]。Zn是多种蛋白质的主要辅酶，对重金属的跨膜运输和进出韧皮部的过程都有重要调控作用^[33-34]。在本试验中，Si和Zn共存时对地上部的K、Fe和Zn含量都有显著的促进作用，必需元素吸收转运效率的提高必然会抑制相关通道对Cd的转运，因而能使根系胞液组分中的Cd含量下降43.9%以上。随着根系中可移动的Cd数量大幅度减少，地上部的Cd总量也显著下降。Si和Zn互补作用使得低浓度的Si也能对Cd在水稻体内的转运产生显著的抑制效果。

植物体内的可溶性蛋白质和可溶性糖作为渗透保护物质，有利于植物在逆境胁迫下维持细胞的结构和功能^[35]。Cd胁迫通常会抑制可溶性蛋白的合成，降低酶的生物活性^[11]。而Si和Zn对维持细胞内大量元素(如P、K、S)和微量元素(如Fe、Cu、Mn、Zn等)的离子平衡发挥着重要作用^[36-38]。这种离子动态平衡的保持与可溶性蛋白的代谢有着密切的关系。环境中增加Si浓度不仅能显著提高Lsi1基因的表达水平，同时还调控OsHMA3、Nramp5等许多与离子转运、金属硫蛋白合成等有关的基因^{[30, 32]}，因而对蛋白质代谢产生重要影响。当Si和Zn共存时，水稻幼苗根部的可溶性蛋白含量显著提升，说明Cd对根系的生理伤害因Si和Zn的存在而修复。由于地上部胞液组分中的Cd含量仅相当于根系胞液中的十分之一，对细胞产生的生理毒害甚微，所以地上部的可溶性蛋白含量在处理间没有表现出显著差异。

4 结论

(1) 在含Cd 2.7 μmol·L^-1的营养液中添加0.1 mmol·L^-1的巯基硅能使水稻幼苗根系和地上部的Cd含量分别下降34.7%和51.8%。

(2) Si和Zn共存时对Cd的抑制作用更加明显，同时添加0.2 mmol·L^-1 Zn和0.05 mmol·L^-1的巯基硅，能使水稻幼苗根系和地上部的Cd含量分别下降27.4%和78.0%。

(3) 同时添加Si和Zn能促进根系对K、Ca、Fe、Zn等元素的吸收以及向地上部的转运，并能显著提高根系中可溶性蛋白的含量。