邻苯二甲酸二甲酯（Dimethyl phthalate，DMP）是一类被广泛应用的人工合成有机化合物^[1]。DMP对生物体具有致畸、致癌、致突变的性质，因此已被美国环保署及中国环境保护局列为优先控制污染物^[2]。DMP与聚合物通过非共价键结合，因此很容易渗透到环境当中。到目前为止，土壤^[3]、大气^[4]、水环境^[5]均已检测出DMP，可见其污染的广泛性。汕头蔬菜产区土壤样品中DMP的含量已超过美国土壤优先控制标准，超标率为38.1%^[6]；青岛市两种土壤中DMP的浓度分别为0.07 mg·L^-1和0.04 mg·L^-1[7]；天津大气PM10样品中DMP占总肽酸酯含量的0.72%~6.72%^[8]；黄河兰州断面^[9]水体中DMP最高检测浓度为6.3×10^-2 mg· L^-1；青岛海岸带表层沉积物中DMP的浓度范围为1.7×10^-3~9.5×10^-2 mg·L^-1[10]。

荧光假单胞菌（Pseudomonas fluorescens）是一类广泛分布于自然界的革兰氏阴性菌，可作为植物抗病菌，其产生的挥发性化合物、硝吡咯菌素等抗生素可抵抗病原真菌对植物造成的病害^[11-12]；又可作为植物根际促生菌，促进植物更好地吸收营养物质，同时还能产生各种酶和代谢物用以抵抗各种生物和非生物的胁迫^[13-14]。

有研究指出DMP污染改变了土壤中微生物的代谢活性和功能多样性，增加了与氮素代谢有关的某些菌属的百分比，从而使土壤有益菌属的百分比降低，对土壤环境产生了不良影响^{[3, 15-17]}。DMP污染严重抑制了黑土中P. fluorescens的生长^[3]，但DMP对细菌细胞的毒理作用尚不清楚。因此，本试验以DMP与P. fluorescens为研究对象，探讨DMP污染对P. fluorescens细胞的损伤机制，为探究DMP生态毒理效应和生物修复技术提供理论基础。

1 材料与方法 1.1 试验材料及试剂

P. fluorescens ATCC13525由中国普通微生物菌种保藏管理中心提供。

牛肉膏蛋白胨培养基：3 g牛肉膏、10 g蛋白胨、5 g NaCl和1 L双蒸水，pH 7.0。加入不同量的DMP，使DMP的终浓度分别为0、10、20、40 mg·L^-1。

实验所用主要试剂如表 1所示。

1.2 实验方法 1.2.1 细菌培养

P. fluorescens 30 ℃，130 r·min^-1过夜培养，将细菌培养液按1%的接种量分别接种到含有0、10、20、40 mg·L^-1 DMP的100 mL灭菌牛肉膏蛋白胨培养基中。以不加DMP的处理为对照组（CK），10、20、40 mg· L^-1DMP浓度为实验组。30 ℃，130 r·min^-1振荡培养细菌至对数生长中期（8 h），进行试验。

1.2.2 平板计数试验

分别取1 mL在不同浓度DMP（0、10、20、40 mg· L^-1）条件下培养5 h和8 h的细菌，再分别将其加入装有9 mL灭菌的去离子水试管中，依次进行浓度稀释，最终取稀释度为10⁸和10⁹的菌悬液100 μL进行平板涂布试验，根据对数生长的数学模型计算细菌比生长速率与代时和DMP污染浓度的相互关系。比生长速率（μ）和代时（G）公式如下：

式中：N_t和N₀分别代表时间8 h和5 h时的细胞数量。

1.2.3 细菌表面Zeta电位试验

取5 mL在不同浓度DMP（0、10、20、40 mg·L^-1）条件下培养8 h的P. fluorescens，于4000 r·min^-1离心10 min，收集菌体，用灭菌的去离子水清洗并且重悬，制备成终浓度为OD₆₀₀=0.8的菌悬液。利用Zeta电位仪测定细菌表面电位^[18]。

1.2.4 细菌膜流动性试验

取10 mL在不同浓度DMP（0、10、20、40 mg·L^-1）条件下培养8 h的P. fluorescens，于4000 r·min^-1离心10 min，弃上清，用灭菌的去离子水清洗并且重悬，制备成终浓度OD₆₀₀=0.8的菌悬液。加入新配制的100 μmol·L^-1的DPH四氢呋喃溶液5 μL，室温避光染色细菌30 min，得到DPH标记的细菌。再利用带有偏振装置的荧光分光光度计测定荧光偏振度P。检测条件：激发波长Ex=360 nm；发射波长Ex=427 nm；激发狭缝5 nm；发射狭缝10 nm^[19]。

1.2.5 透射电镜（TEM）试验

取1.5 mL在不同浓度DMP（0、10、20、40 mg·L^-1）条件下培养8 h的P. fluorescens，用灭菌的去离子水清洗并且重悬。取菌悬液100 μL于锡箔纸上，自然风干后分别在2.5%戊二醛与1%锇酸中于4 ℃下固定4 h，然后用30%、50%、70%、85%和95%的乙醇梯度脱水，再经100%乙醇脱水2次，脱水后冻干。将冻干的样品经Eponate 812环氧树脂包埋，超薄切片（70 nm左右）后，经醋酸铀-柠檬酸铅双染，透射电子显微镜观察菌体表面形态变化^[20]。

1.2.6 DMP在P. fluorescens细胞内外的分布

取10 mL在不同浓度DMP（0、10、20、40 mg·L^-1）条件下培养8 h的P. fluorescens，4000 r·min^-1离心10 min，收集上清液于干净的试管中，再加入5 mL灭菌的去离子水洗涤一次，将上清液与试管中的溶液合并，用于测定细胞外DMP浓度；剩余沉淀细菌加5 mL灭菌的去离子水重悬，通过超声波细胞粉碎机破碎细胞，11 000 r·min^-1离心10 min后收集上清液，用以测定细胞内DMP浓度^[21]。每个样品分别用相同体积的乙酸乙酯萃取，取上层有机相于旋转蒸发仪中蒸干，再用色谱级甲醇定容至10 mL，取1 mL溶液置于液相小瓶中，通过高效液相色谱检测其中的DMP含量。检测条件为流动相：90%甲醇，10%水；柱温：30 ℃；流速：0.5 mL·min^-1；检测波长228 nm^[22]。

1.3 数据处理

所有实验均进行3次平行处理，实验数据以平均值±标准差表示，数据采用SigmaPlot 12.5进行图表绘制，SPSS 22.0软件进行统计分析，P < 0.05具有统计学意义。

2 结果与讨论 2.1 P. fluorescens比生长速率与代时和污染浓度的关系

对数生长的数学模型在现代微生物学中的应用越来越重要，它能较明确地表达生命现象的动态过程。如图 1A所示，与CK相比，随着DMP污染浓度增加，比生长速率逐渐减小，说明DMP污染浓度越大，细菌每小时增加的数量越少，即生长速度缓慢。从图 1B可以看出，随着DMP污染浓度增加，代时（每个细菌分裂繁殖一代所需的时间）越长。此试验表明随着DMP污染浓度增加，细菌个体繁殖速度迟缓且生长速率缓慢。这与Wang等^[23]研究表明较大的DMP浓度对P. fluorescens的生长和葡萄糖的利用有很大抑制作用的结果一致。

2.2 P. fluorescens表面Zeta电位变化

细胞壁是细菌的重要结构，同时也是保护细胞免受外界损伤的第一层保障^[24]。P. fluorescens表面Zeta电位变化如图 2所示，CK的表面电势为-12.21±0.56 mV。随DMP污染浓度增加，细菌表面Zeta电位逐渐减小，最低为-18.13±0.67 mV。细菌含有独特的细胞壁结构，包括肽链和氨基糖链组成的肽聚糖及其他蛋白质、多糖类物质，这是细菌表面带有负电荷的原因。Liu等^[18]用低浓度全氟辛烷磺酸和全氟辛酸处理大肠杆菌后细菌表面Zeta电位降低，与本研究结果一致。可能是细菌免疫产生蛋白和脂多糖以减少自身损伤的结果，或由于细胞内电荷的内容物流出，附着在细菌表面，降低细胞表面所带的负电荷，导致Zeta电位的减小^[25]。DMP对P. fluorescens的毒理作用机制，在微观上首先表现为DMP对细菌细胞壁结构的破坏。

2.3 P. fluorescens膜流动性变化

生物细胞膜是细胞与外界环境之间的重要屏障，可维持细胞的基本代谢，保护细胞免受外界干扰，其中流动性是维持细胞膜发挥正常功能的关键。疏水性荧光探针DPH已经被广泛用于细胞膜流动性的研究，DPH荧光偏振度与目标生物膜的流动性密切相关：膜流动性增加会降低荧光偏振度P，反之亦然^[26-28]。如图 3所示，经DMP污染后，P. fluorescens细胞膜流动性明显改变，随着DMP处理浓度的增加，DPH的荧光偏振度从0.194逐渐降低到0.174，细胞膜流动性显著增加。膜流动性的增加可能会破坏细菌细胞的结构，导致细胞质壁分离，同时细胞内含物会暴露在外部环境中，这也可能是电负性下降的原因^[18]。有报道称化合物全氟辛烷磺酸、蒎烯和四氢萘也会引起细菌细胞膜流动性增加^[29-30]，因此我们猜测P. fluorescens膜流动性的增加可能是因为DMP导致细菌的脂肪酸链排列松散，破坏细菌的脂双层结构，进而影响膜的功能^[19]。

2.4 TEM电镜观察

TEM电镜观察结果如图 4所示，可以看出未经DMP污染的P. fluorescens纵切面细胞壁和细胞膜完整；横切面表面光滑，无明显变形。而DMP污染后，P. fluorescens纵表面出现明显的质壁分离、表面褶皱（黑色箭头）；横切面凹凸变形明显（白色箭头）；同时出现了某些细胞内容物的释放（白色圆圈）。TEM图明显说明了P. fluorescens受到DMP污染后，细胞壁和细胞膜遭到破坏。

2.5 DMP在P. fluorescens细胞内外分布

赵晓松等^[31]发现DMP可以与DNA进行嵌插性的结合，改变DNA的结构。王志刚等^[32]研究发现DMP污染会抑制Bacillus subtilis B19、Escherichia coli K12生长，对细菌产生氧化损伤，引起细菌氧化应激。DMP在P. fluorescens细胞内外的分布见图 5。由图可知，培养基中的DMP浓度随着DMP添加量的增加而增加。在DMP处理浓度为40 mg·L^-1时，培养基中的DMP检测值达到最大，检测浓度为30.52±0.88 mg· L^-1。从图中还可以看出，在10、20、40 mg·L^-1DMP浓度处理下的P. fluorescens细胞内检测到的DMP浓度越来越高，从0.11±0.10 mg·L^-1升高到了6.78±0.25 mg·L^-1。这说明当P. fluorescens受到DMP污染时，DMP会破坏细胞壁和细胞膜后进入到细胞内，并且随着DMP浓度的增加，细胞壁和细胞膜的破坏程度越大，进入细胞内的DMP浓度越高。

3 结论

（1）DMP污染P. fluorescens，导致细菌细胞膜特性改变，其中膜流动性、通透性增加，同时也导致细胞壁表面电位降低，细胞内容物泄露。

（2）DMP污染导致了P. fluorescens比生长速率减小，代时增加。

（3）DMP可以破坏P. fluorescens的细胞壁和细胞膜后渗透进入细菌内，影响细菌正常生长。