镉（Cd）是一种对人体毒性较高的有害重金属元素^[1]。由工、农业生产导致的环境污染，已经使我国有大约2.786×10⁵ hm²的农用地受到Cd污染^[2]，耕地Cd污染点位超标率高达7%^[3]，农田Cd污染已成为重要的农业环境问题。水稻籽粒中的Cd主要来源于土壤^[4]，土壤轻度Cd污染即可导致稻米Cd含量超过国家食品安全限量标准^[5]，由食用稻米导致的Cd摄入量占我国人群Cd摄入量的56%^[6]。由于土壤Cd污染的隐蔽性、累积性和长期性以及Cd在水稻中累积受其自身形态^[7-9]、作物品种及生育期^[10-11]等多种因素影响，我国大面积稻田Cd污染治理技术难度大，国内外至今仍缺乏成熟且能被大面积推广应用的修复技术^[12-14]。因此，研发环境友好、农户可接受且易于大面积推广的农艺生产措施，对保障水稻安全生产具有重要意义。

Cd向水稻籽粒迁移转运的机制十分复杂。水稻通过木质部从根向茎转运Cd的能力是决定水稻茎秆中Cd积累浓度的主要影响因素^[15]。Cd进入水稻茎、叶等组织后则主要通过韧皮部向水稻籽粒中转运，几乎100%的籽粒Cd来源于韧皮部运输^[16-17]。在水稻开花期调控Cd经韧皮部向籽粒中转运是一种降低水稻籽粒Cd含量的重要途径。近年来，大量研究表明在水稻开花期喷施Si^[18-19]、Se^[20]、Zn^[21]、Mn^[22]等元素，可以显著降低Cd在水稻籽粒中的累积量。此外，在水稻开花期喷施小分子酸类物质也可以显著降低水稻籽粒中的Cd含量^[23]。当前，在水稻开花期喷施叶面调理剂已成为一种降低水稻籽粒Cd含量的重要农艺措施，具有广泛的应用前景。

重金属螯合剂2，3-二巯基丁二酸（DMSA）分子中含有两个巯基，可以与多种有毒重金属如Cd²⁺、Pb²⁺、Hg²⁺等形成稳定的螯合物^[24]，在医疗上可以作为重金属中毒的解毒剂。该化合物具有水溶性较好、毒性低的特点，在全球范围内得到广泛应用^[25]。本研究于水稻开花期叶面喷施一次DMSA以探索喷施DMSA调控水稻韧皮部Cd转运降低水稻籽粒中Cd含量的可行性，并探讨DMSA降低水稻籽粒中Cd含量的潜在机制。

在湖南省湘阴县鹤龙湖镇黄花岭村选择土壤和稻米Cd含量均超标的水稻田进行试验。试验田土壤类型为水稻土，其基本理化性质为：pH 6.21，有机质40.83 g·kg^-1，全氮0.173%，全磷0.019%，全钾1.3%，速效钾83.87 mg·kg^-1，速效磷16.2 mg·kg^-1，阳离子交换量18.92 cmol·kg^-1，Cd 0.71 mg·kg^-1，Mn 360.71 mg·kg^-1，Zn 172.71 mg·kg^-1。

以当地主栽品种黄花占为试验材料，种子购于当地种子公司。2，3-二巯基丁二酸（DMSA）购于国药集团，分析纯。

田间小区面积设定为10 m²（5 m×2 m）。试验小区共分1个对照处理组和3个试验处理组，每个处理组重复4次。将适量DMSA溶于1 mol·L^-1的KOH溶液中，用田间灌溉水稀释至2 L，用0.5 mol·L^-1的HCl调节pH为8.0~8.5，分别配制成2、3、4、5 mmol·L^-1的DMSA水溶液。于水稻开花期向叶面手动均匀喷施处理液1次。对照组喷施2 L pH为8.0~8.5的田间灌溉水。

水稻采用旱育秧方式，于2018年7月18日移栽。施肥方法依照水稻测土配方施肥技术，每公顷施用尿素398 kg、钾肥210 kg，其中基肥占总施肥量的62%，分蘖肥占总量的29%，穗粒肥占总量的9%。整个生育期无显著病虫害发生。

于水稻成熟期，选取小区中心长3.0 m、宽1.5 m处喷施较为均匀部分，用铁锹每小区随机连根挖取3株水稻植株，装入网袋。常温自然风干后手动将水稻植株分为籽粒、穗轴、穗颈、旗叶、顶端第一节、顶端第二节、顶端第二叶、顶端第二节间、基部茎叶、根，共计10个部分。用蒸馏水漂洗3次后于70 ℃烘干72 h，凉却至室温后将各部分磨粉，分别收集到自封袋中，以备消解。

参照Liu等^[10]的方法，分别称取磨碎后的植株样品约0.25 g于消解管中，加入7 mL浓硝酸，摇匀，室温下静置12 h。将消解管放入电热消解仪上进行消解，110 ℃加热2.5 h后冷却至室温，再向消解管中加入1 mL H₂O₂摇匀，110 ℃继续加热1.5 h。将消解管内的液体于170 ℃下赶酸至0.5 mL以内，再将消解液稀释并转移至25 mL容量瓶内定容，用ICP-MS测定样品中Cd、K、Ca、Mg、Fe、Mn、Zn含量。本方法对7种元素的回收率为95%~105%，检出限为0.3~5.5 µg·kg^-1。

采用Microsoft Excel进行相关数据的计算、统计与处理。利用SPSS 17.0软件进行统计分析，新复极差法（Ducan′ s）进行多重比较、差异显著性检验。利用Origin 2018作图。

由图 1A可见，籽粒中Cd含量随着DMSA喷施浓度增加表现出显著的降低趋势，与对照相比籽粒中Cd含量降低幅度为15.84%~46.09%。但当DMSA使用浓度高于4 mol·L^-1时，籽粒中Cd含量未表现出持续下降，表明继续增加DMSA用量已不能起到持续降低籽粒Cd含量的效果。穗轴Cd含量也表现出显著下降趋势，不同处理Cd降低幅度为10.03%~41.41%，同样当DMSA喷施浓度高于4 mol·L^-1时穗轴中Cd含量也未出现持续降低现象。

图中不同小写字母表示处理间差异达到5%显著水平（n=4）。下同 Different lowercase letters indicate significant differences between different treatments at 5% level (n=4). The same below 图 1 喷施DMSA对水稻各器官中Cd含量的影响 Figure 1 Effects of foliar application of DMSA on Cd content in rice organs

由图 1B可见，喷施DMSA后不同处理间旗叶中Cd含量与对照相比未出现显著差异，但是穗颈和顶端第一节中Cd含量出现显著降低，两种器官中Cd含量与对照相比的降低幅度为9.13%~28.46%和18.30~38.32%。

由图 1C可见，喷施DMSA后不同处理间顶端第二叶和顶端第二节中Cd含量与对照相比未出现显著差异，但是顶端第二节间Cd含量则呈现出随DMSA喷施浓度增加而显著降低的趋势，降低幅度为11.00%~34.76%。

由图 1D可见，喷施DMSA后不同处理间基部茎叶和根中Cd含量无显著差异。

Cd在水稻不同器官中的浓度分布反应了其在水稻器官间的迁移能力，一般用转移系数来表示。转移系数为相邻器官间Cd含量的比值：

由图 2A可见，在水稻开花期叶面喷施一次DMSA后，Cd由穗颈向穗轴的转移系数（TF_{穗轴/穗颈}）随着DMSA喷施浓度的增加表现出逐渐降低的趋势，但不同处理间转移系数的差异尚未达到显著水平。由图 2B可见，当喷施DMSA后，Cd由旗叶向顶端第一节的转移系数发生了显著变化，随着DMSA喷施浓度的增加，Cd由旗叶向顶端第一节的转移系数（TF_{顶端第一节/旗叶}）呈显著降低趋势，表明喷施DMSA减少了Cd由旗叶向顶端第一节的转运。开花期喷施DMSA对Cd在其他器官间的转移系数没有显著改变，表明喷施DMSA对Cd在其他器官间的迁移转运没有显著影响。

图 2 喷施DMSA对水稻各器官间转移系数的影响 Figure 2 Effects of foliar application of DMSA on the transfer factors between rice organs

水稻开花期叶面喷施一次DMSA对水稻籽粒和穗轴中的矿质元素含量影响如图 3所示。由图 3A至图 3E可见，喷施DMSA对水稻籽粒和穗轴中的K、Mg、Ca、Fe、Zn含量的影响不大，4个处理中矿质元素含量与对照相比未形成显著差异。但是，喷施高浓度DMSA对籽粒和穗轴中的Mn含量造成显著影响（图 3F），与对照组相比喷施DMSA导致籽粒和穗轴中Mn含量分别降低5.79%~17.87%和13.51%~24.21%，表明水稻开花期叶面喷施DMSA影响了Mn向水稻籽粒中的转运。

图 3 喷施DMSA对水稻籽粒和穗轴矿质元素含量的影响 Figure 3 Effects of foliar application of DMSA on mineral elements concentration in grains and rachises

动物实验表明，DMSA在体内通过分子中含有的两个巯基与Cd形成稳定的螯合物，最终以螯合态排出体外从而达到降低Cd毒性的目的^[24-25]。有研究表明，Cd在水稻韧皮部伤流液中大部分与蛋白类、植物螯合素等物质以结合态存在，小部分以离子形式存在^[26]。蛋白螯合态的Cd并非一种稳定形态，当遇到蛋白激酶后又会重新释放出Cd²⁺。当DMSA进入水稻体内后可与Cd²⁺竞争性结合形成螯合物。植物自身也可合成多种含有巯基的解毒化合物如PCs^[27]、谷胱甘肽等^[28]，它们都可以与Cd²⁺形成稳定的化合物并储存在植物液泡等器官中^[29]，不仅降低了Cd对植物的胁迫效应，而且在一定程度上也降低了Cd向地上部的转运。据此推断，在水稻开花期叶面喷施DMSA主要是通过与水稻叶片等组织中的Cd²⁺形成螯合物来降低Cd向籽粒中的转运。可见，喷施DMSA降低籽粒中Cd含量的机制与喷施Zn^2+[21]、Mn^2+[22]等通过离子拮抗降低Cd向水稻籽粒中转运导致籽粒中Cd含量降低的机制有所不同，也与喷施Si^[18]增加水稻茎和叶片细胞壁固持Cd能力从而降低Cd向籽粒转运的机制不同。为降低水稻籽粒中Cd含量，育种学家引入了基因编辑技术。当敲除负责调控水稻转运Cd和Mn的Nramp5基因^[30]后，无论是粳稻还是籼稻籽粒中Cd和Mn的浓度都出现大幅度降低，其中Mn浓度可下降80%以上^[31-32]。在本研究中，喷施DMSA对水稻籽粒和穗轴中必需营养元素K、Mg、Ca、Fe、Zn的含量没有显著影响，但是在降低籽粒中Cd含量的同时也显著降低了籽粒中Mn的浓度。喷施DMSA是否影响了Nramp5等基因的表达仍有待进一步研究。

关于水稻籽粒中Cd的来源日本学者给出了相互矛盾的结论。Fujimaki等^[33]利用¹⁰⁷Cd同位素示踪技术的研究结果表明，在灌浆期水稻从土壤中吸收的Cd被运送到籽粒；Kashiwagi等^[34]的研究结果表明水稻籽粒中Cd主要来自于抽穗前累积在叶片和茎秆中的Cd，抽穗后从根运送到茎秆和穗部的Cd不影响糙米中Cd的累积。喻华等^[11]进一步研究表明，在田间水稻齐穗后土壤中有效Cd含量较低时，籽粒中的Cd同时来自于土壤和水稻体内在齐穗前累积的Cd。叶片是向籽粒净转移Cd的主要器官，叶片衰老期Cd通过韧皮部向籽粒转移是Cd再分配的主要过程^[35]。在本研究中，随着DMSA喷施浓度增加水稻籽粒中Cd含量呈现出显著降低趋势，最高降幅达到46.09%（图 1A），而旗叶中Cd含量则未出现显著降低（图 1B），表明喷施DMSA降低了旗叶中Cd经顶端第一节向籽粒的转运，对水稻籽粒Cd含量的降低具有较大贡献。Feng等^[36]的研究表明，水稻的根和节是Cd进入水稻地上部的主要障碍，这两个部位的Cd含量最高，当外界有效Cd含量较低时，进入水稻体内的大部分Cd被固定到这两个部位，这时水稻器官中Cd的再转运成为籽粒中Cd的主要来源。在本研究中开花期喷施DMSA显著降低了顶端第一节中Cd的含量（图 1B），此现象与喷施纳米硅^[19]降低籽粒Cd含量的现象一致，表明顶端第一节中Cd含量的降低对籽粒Cd降低也具有较大贡献。

当开花期叶面喷施DMSA后，显著降低了Cd由旗叶向顶端第一节的转移系数（图 2B）。同时Cd由穗颈向穗轴的转移系数（图 2A）也出现降低趋势但并未达到显著程度，其他器官中Cd的转移系数并未见发生显著变化。此结果与喷施DMSA后水稻叶片中Cd含量未见显著变化相互印证。说明喷施DMSA影响籽粒中Cd含量降低的主要因素是降低了叶片Cd向籽粒的输送。

DMSA对人体的毒性较低，可以在医疗上作为人体Cd、As、Pb、Hg等^[24-25]重金属中毒后的解毒剂，因此其对人体的安全性很高。目前，利用DMSA阻控Cd向水稻籽粒中转运的研究鲜有报道，同时也未见DMSA是否对植物生长有负面影响的报道。本研究中同时开展了喷施DMSA对水稻产量影响的研究，稻谷产量与对照相比未见显著差异（本文未提供具体数据）。当DMSA的喷施浓度超过4 mmol·L^-1时水稻籽粒和穗轴中Cd含量并未出现持续降低（图 1A），此结果为农业生产实践中DMSA的实际用量提供了指导。

（1）在水稻开花期叶面喷施DMSA可以显著降低籽粒中Cd含量。田间试验表明，喷施一次DMSA使籽粒中Cd最高降幅可达46.09%。

（2）旗叶Cd向顶端第一节中的迁移率降低对籽粒Cd含量降低有较大贡献。喷施DMSA显著降低了Cd由旗叶向顶端第一节中的迁移系数，表明与对照相比旗叶中Cd向籽粒中转运量显著减少。

（3）巯基化合物DMSA是一种潜在的降Cd叶面调理剂，具有较好的应用前景。