2019, Vol. 38
2. 湖南省灌溉水源水质污染净化工程技术研究中心, 长沙 410128;
3. 重金属污染耕地安全高效利用湖南省工程研究中心, 长沙 410128
2. Engineering Research Center for Water Pollution Purification of Irrigation Source in Hunan Province, Changsha 410128, China;
3. Hunan Engineering Research Center for Safe and High-Efficient Utilization of Heavy Metal Pollution Farmland, Changsha 410128, China
土壤重金属污染是当今最为突出的环境问题之一，其中，镉（Cd）已成为我国受污染土壤中最主要的重金属类污染物[1]。20世纪60年代，日本富山县神通川流域出现“痛痛病”，就是由Cd引起的公害事件，引起人们对重金属污染问题的高度重视[2]。Cd对人类和其他动植物均有毒害作用。研究发现，Cd容易被植物尤其是一些农作物吸收并富集，Cd胁迫下的植物会表现出一系列不良症状，如生长抑制、植株矮小、萎黄病等，这都可能导致植物生物量大幅降低[3-5]。彭鸥等[6]研究发现水培条件下，当Cd2+浓度为0.2~1 mg·L-1时，水稻各农艺性状与不加Cd的对照组相比均显著降低，且Cd2+浓度越高，水稻产量越低。Cd会通过食物链在动物体肝、肾等器官中累积，影响生理代谢，从而对动物体各大系统产生不同程度的损害[7-9]。
近年来，微生物修复技术因其环境友好性和投入低等优点受到广泛关注。微生物作为土壤中的重要组成部分，具有比表面积大、带电荷、代谢活动旺盛、种类繁多、数量大等特点，有的土壤微生物不仅参与土壤中污染物的降解或转化过程，还可作为环境载体吸附重金属污染物[10]。本文使用的细菌（Delftia sp. B9）是从Cd污染土壤中筛选分离的一株耐镉细菌[11]，该菌株已被证明能使土壤中的Cd从弱酸可溶态向可还原态和残渣态转化。已有大量研究报道该菌属细菌能够降解或转化有机和无机污染物[12-14]。Prakash等[15]报道了D.tsuruhatensis AR-7可以通过胞内积累或细胞膜吸附将Se4+转化为Se0，Caravaglia等[16]和Ubalde等[17]报道了Cr（Ⅵ）抗性菌D. acidovorans AR和Delftia sp. JD2对Cr（Ⅵ）的生物转化，可将Cr（Ⅵ）还原成毒性较低的Cr（Ⅲ）。此外，有相关研究[18-19]表明，Delftia菌属菌株能够产生植物促生物质，有效抑制病原菌活性，提升作物质量和产量。然而，重金属Cd胁迫下Delftia菌属菌株对水稻生长及积累Cd的研究较少，Delftia sp. B9在促进水稻生长及减少累积Cd中具有很大的发展潜力和应用价值。
本文使用耐镉细菌Delftia sp. B9，研究不同Cd浓度对菌体产铁载体和产吲哚乙酸（IAA）能力的影响，并将菌体添加于Cd胁迫下水稻种子发芽及幼苗试验，研究其对水稻种子萌发及幼苗积累Cd的影响，为耐镉菌株的应用提供理论参考。
1 材料与方法 1.1 试验材料液体培养基：牛肉膏3 g、蛋白胨10 g、氯化钠5 g、蒸馏水1 L，pH 7.2~7.4，121 ℃高压灭菌锅灭菌30 min。
菌株及菌悬液制备：测试菌株为Delftia sp. B9（基因登录号为MF679148，菌种保藏号为CGMCC No.16073，简称B9）。将Delftia sp. B9接种于液体培养基中30 ℃、120 r·min-1培养24 h，用无菌水洗涤两次后制成OD600=1.6（7.6×108 cfu·mL-1）的菌悬液（菌悬液1，菌液浓度设置参考王秋菊等[20]），然后用无菌水将菌悬液1稀释10倍（菌悬液2，7.6×107 cfu·mL-1）、100倍（菌悬液3，7.6×106 cfu·mL-1）、1000倍（菌悬液4，7.6×105 cfu·mL-1）的稀释液，备用。
水稻品种：华润2号（常规稻，全生育期119 d）；深两优5814（籼型两系杂交水稻，全生育期137 d）。
1.2 Cd胁迫对Delftia sp. B9产铁载体和产IAA能力的测定用MKB液体培养基[21]培养菌株，采用CAS检验法[21]测定菌株合成铁载体的能力。菌株产铁载体的能力用铁载体活性单位（Siderophore unit，SU）表示，铁载体活性单位的计算公式：
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式中：Ar表示未接种菌液下的OD630值，As表示接种菌液下的OD630值。SU数值大小与菌株产铁载体能力呈正相关。
菌株分泌IAA的能力采用Salkowski比色法[22]测定。
试验各处理如下：（1）B9；（2）B9+Cd1（0.01 mg·L-1 Cd）；（3）B9+Cd2（0.1 mg·L-1 Cd）。Cd浓度设置根据《农田灌溉水质标准》（GB 5084—2005），灌溉水中Cd允许的最大排放浓度为0.01 mg·L-1，以此作为Cd胁迫处理的低浓度，同时设置0.1 mg·L-1作为Cd胁迫处理的高浓度。
1.3 种子萌发试验 1.3.1 不同浓度Delftia sp. B9菌液对水稻种子萌发的影响试验采用光照培养箱培养方法。选取大小一致、籽粒饱满的水稻种子用2%的H2O2消毒6 min，再用去离子水反复冲洗3~5遍，将种子放入去离子水中浸种24 h后，均匀播于铺有2层滤纸的培养皿（直径为12 cm）中，每皿铺放30粒。分别加入1.1中制备的不同浓度的菌悬液20 mL，以添加无菌水的处理作为对照。各处理如下：（1）CK：无菌水；（2）B1：菌悬液1；（3）B2：菌悬液2；（4）B3：菌悬液3；（5）B4：菌悬液4。盖上培养皿盖，置于培养箱内以光照16 h、黑暗8 h进行培养，条件控制温度为30 ℃。于培养7 d后统计发芽数，以幼芽达到种子长度一半，幼根与种子等长作为发芽标准，1次支根数以根长与种子等长为标准[23]。培养期间喷洒菌液使滤纸保持湿润。
1.3.2 Delftia sp. B9菌液对Cd胁迫下水稻种子萌发及幼苗耐Cd性试验种子萌发的方法按照1.3.1中进行，分别加入20 mL不同处理溶液浸润的种子，盖上培养皿盖，置于培养箱内以光照16 h、黑暗8 h进行培养，条件控制温度为30 ℃。培养期间每日记录种子发芽数，并在培养7 d后统计发芽数、幼根及幼芽长度，根系、幼芽长度用1/10 cm尺子人工测量。培养期间喷洒菌液使滤纸保持湿润（菌液浓度根据1.3.1结果选择7.6×106 cfu·mL-1）。各处理具体操作见表 1。水稻种子的发芽率、发芽指数、活力指数、耐性系数和胁迫指数的计算公式为：
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表 1 Cd胁迫下水稻种子发芽试验 Table 1 Experiment on germination of rice seeds under Cd stress |
幼苗培养使用营养液：1 L木村B营养液中添加1 mL Arnon A-Z微量元素营养液[26-27]。
种子萌发的方法按照1.3.1中进行，种子萌发时每日适当补充蒸馏水。待水稻幼苗长到两叶一心时移栽到烧杯中，移栽后加入培养液进行培养，初始移栽时用1/3营养液，15 d后用1/2营养液。营养液中Cd以CdCl2·2.5H2O的形式加入，菌悬液经无菌水洗涤后加入并保持一定浓度（菌悬液浓度根据1.3.1结果选择7.6×106 cfu·mL-1）。培养液每5 d更换一次，调节pH至5.5~6.0。培养条件如表 2所示，每个处理3个重复。分别在水稻移栽后的第1、3、5、10、15、20、30 d对水稻幼苗苗长和根长进行测量。
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表 2 幼苗生长试验处理 Table 2 Experiment on growth of rice seedlings |
培养条件如表 2所示，分别在水稻移栽后的第1、3、5、10、15、20、30 d采集水稻幼苗，叶绿素含量测定参照王备芳等[28]的方法进行，叶绿素a（Chlorophyll-a，Chl a）、叶绿素b（Chlorophyll-b，Chl b）计算公式：
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式中：V表示提取液的体积，10-3 L；W表示叶片的质量，g。
1.5 Delftia sp. B9对Cd胁迫下水稻转运和吸收Cd的影响试验培养条件如表 2所示，在水稻移栽后的第30 d收集水稻样品，用自来水洗净水稻植株，将植株根、茎、叶进行手工分离，并置于105±2 ℃烘箱内杀青1 h，然后在65±2 ℃下烘干至恒质量。水稻样品采用混合酸（HClO4：HNO3=1：4）湿法进行消解，消解时每个样品3个重复，每一台消解仪上有3个空白样品和3个质控样品。Cd浓度在0.1 mg·L -1以上的样品用ICP-OES（美国PE8300）进行测定，Cd浓度在0.1 mg·L-1及以下的样品采用原子吸收分光光度计-石墨炉法（GTA120，美国Varian）测定。消解液不能及时测定时应放入冰柜冷藏保存。
1.6 数据处理试验数据采用Office 2013、SPSS 22.0软件进行分析与作图，差异显著性采用ANOVA单因素方差分析。
2 结果与分析 2.1 Cd胁迫对Delftia sp. B9产铁载体IAA能力的影响由表 3可知，Delftia sp. B9具有产铁载体和产IAA的能力，其中，铁载体活性单位（SU）为64.68%，OD630的As/Ar为0.35，As/Ar代表细菌产铁载体的相对含量，该值越低SU值越高，表明产生的铁载体的含量越高。一般产铁载体能力较高的细菌As/Ar值低于0.5[29]，因此，Delftia sp. B9是一株高产铁载体的细菌。Delftia sp. B9中产生的IAA质量浓度为56.08 mg·L-1。当培养基中Cd浓度为0.01 mg·L-1时，均能提高B9产铁载体和产IAA的能力，但未出现显著性差异。当培养基中Cd浓度为0.1 mg·L-1时，B9产铁载体和产IAA的能力显著下降，As/Ar值为0.53，为中等产铁载体能力。
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表 3 Cd胁迫对Delftia sp. B9产铁载体和产IAA能力的影响 Table 3 Effects of siderophore and IAA production by Delftia sp. B9 under Cd stress |
不同浓度菌液对不同品种水稻种子发芽率的影响见图 1，添加B1和B2的两个处理对两个水稻品种的萌发有明显的抑制作用。与CK组相比，添加B1和B2使华润2号种子发芽率分别降低40.10%、16.87%；深两优5814种子发芽率分别降低40.44%、20.22%。添加B3和B4的处理对两个品种水稻种子的发芽率与CK相比无显著差异。后续实验中考虑到Cd浓度的胁迫作用，选用菌液B3（7.6×106 cfu·mL-1）作为添加量。
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不同小写字母表示不同处理间差异显著（P＜0.05）。下同 The different lowercase letters represent the significant difference within each treatment using one-way ANOVA(P < 0.05). The same below 图 1 不同浓度Delftia sp. B9菌液对水稻种子发芽率的影响 Figure 1 Effects of different concentrations of Delftia sp. B9 on germination rate of rice seeds |
如表 4所示，Cd处理浓度为0.01 mg·L-1时（T3），华润2号的种子发芽指数和活力指数与对照T1相比都有显著提高，种子发芽率与T1相比虽有提高，但未达到显著差异；深两优5814的种子发芽率、发芽指数与T1相比无显著差异，活力指数显著增加。当Cd处理浓度为0.01 mg·L-1并且添加Delftia sp. B9菌液时（T4），华润2号的种子发芽率、发芽指数、活力指数与T3相比均显著降低；深两优5814的活力指数与T3相比显著降低。
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表 4 不同浓度Cd胁迫下添加Delftia sp. B9对水稻种子萌发的影响 Table 4 The effects of Delftia sp. B9 on seed germination under Cd stress |
Cd处理浓度为0.1 mg·L-1时（T5），华润2号的种子发芽率与T1相比显著降低，发芽指数、活力指数与T1相比显著提高；深两优5814的种子发芽率、发芽指数与T1相比无显著差异，活力指数显著降低。当Cd处理浓度为0.1 mg·L-1并且添加Delftia sp. B9菌液时（T6），华润2号的种子发芽率、发芽指数、活力指数与T5相比均显著增加；深两优5814的活力指数与T5相比显著增加。T6处理下华润2号的种子发芽指数和活力指数与T1相比显著提高。
由表 5可以看出，当Cd处理浓度为0.01、0.1 mg·L-1时，华润2号T3处理的耐性系数显著高于T1，T6处理的耐性系数与T1相比未出现显著差异，但显著高于T5处理，T2、T3处理的胁迫指数比T1分别减小0.02、0.05，T4、T5、T6处理的胁迫指数与T1相比分别显著增加0.02、0.14、0.02；深两优5814的T3、T6耐性系数均显著高于T1，T2、T5、T6处理的胁迫指数均高于T1。Cd胁迫浓度高时（0.1 mg·L-1），对水稻种子发芽的胁迫指数：华润2号＞深两优5814。添加菌液对水稻种子发芽的胁迫指数：华润2号＞深两优5814。
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表 5 不同浓度Cd胁迫下添加Delftia sp. B9对水稻幼苗耐Cd性的影响 Table 5 The effects of Delftia sp. B9 on Cd-tolerance of rice seedlings under Cd stress |
由表 6可知，在水稻移栽培养后的第5 d，华润2号和深两优5814的3个处理水稻根长出现差异，E2与E1相比未出现显著差异，E3与E2、E1相比根长均显著增加，且这种差异一直到培养的第30 d。华润2号在培养15 d时，E3与E1、E2相比株高显著增加；第30 d时E3处理比E1、E2处理株高分别增加3.86、5.76 cm；在培养第20 d时，E2处理与E1相比株高显著降低，第30 d时E2处理比E1处理株高减少1.90 cm。深两优5814在培养15 d时，3个处理的株高之间出现显著差异，大小为E3＞E1＞E2；第30 d时E3处理比E1、E2处理株高分别增加2.16、4.34 cm，E2处理比E1处理株高减少2.18 cm。
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表 6 不同处理下水稻幼苗长势（cm） Table 6 The effects of Delftia sp. B9 on Cd-tolerance of growth tendency of rice seedling(cm) |
由表 7可知，水稻华润2号幼苗在移栽后第5 d，E2处理与E1、E3相比Chl a含量显著减少；培养到第20 d时，E3处理与E1、E2相比显著增加；到培养的第30 d，E3处理与E1、E2相比Chl a分别增加了0.81、2.29 mg·g-1，E2处理与E1相比Chl a显著减少1.48 mg·g-1。深两优5814幼苗在移栽后第5 d，Chl a含量在3个处理间出现显著差异，到培养的第30 d，Chl a含量为E3＞E1＞E2，E3处理与E1、E2相比Chl a分别增加了1.55、2.98 mg·g-1，E2处理与E1相比Chl a显著减少1.43 mg·g-1。
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表 7 不同处理下水稻叶绿素含量（mg·g-1） Table 7 The differences of chlorophyll contents among different treatments(mg·g-1) |
华润2号幼苗在移栽后第5 d，E3处理与E1相比Chl b含量显著增加，到培养的第30 d，E3处理与E1、E2相比Chl b分别增加了1.06、1.51 mg·g-1，E1处理与E2之间Chl b有所差异，但未达到显著水平。深两优5814幼苗在移栽后第5 d，E3处理与E1、E2相比Chl b含量显著增加，到培养的第30 d，E3处理与E1、E2相比Chl b分别增加了0.73、0.99 mg·g-1，E2处理与E1相比Chl b显著减少0.26 mg·g-1。
2.4 Delftia sp. B9对Cd胁迫下水稻转运和吸收Cd的影响由图 2可知，两种水稻在移栽培养30 d后各部位Cd含量相差较大，且同一部位3个处理间Cd含量也相差很大。对照组（E1）根、茎、叶中也含有Cd，其可能来源于营养液配制所需使用的药品，其中含有微量的Cd。在Cd胁迫下（E2）华润2号根、茎、叶中Cd含量分别达到129.26、47.43、16.87 mg·kg-1，添加Delftia sp. B9菌液的处理（E3）中Cd含量分别达到46.78、15.37、4.92 mg·kg-1，与E2相比分别减少了82.48、32.06、11.95 mg·kg-1，减少率分别达到63.81%、67.59%、70.84%。深两优5814在T2处理下根、茎、叶中Cd含量分别达到89.35、30.29、9.64 mg·kg-1，E3中Cd含量与E2相比分别减少了67.86、22.67、7.79 mg·kg-1，减少率分别达到75.95%、74.84%、80.81%。同时，深两优5814各部位Cd含量均低于华润2号。
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图 2 不同处理水稻幼苗各部位Cd含量 Figure 2 Cadmium concentration in various parts of rice seedling of different treatments |
种子萌发是植物实现天然更新的关键环节[30]，是植物个体发育早期的生活史特征，影响结实率和成活率等后期生活史特征[31]。水稻是我国主要粮食作物之一，水稻萌发时期生长状况直接影响作物以后的生长和产量。Liu等[32]提出选育水稻品种时，不应只关注水稻的Cd吸收积累特性，还要关注水稻幼苗时期的生长情况。种子发芽率、发芽指数是衡量农作物种子发芽能力的重要指标，反映了种子发芽速度与整齐度的潜势，发芽指数能够反映种子在整个发芽期的综合活力。活力指数是反映种子品质的重要参数，既能反映种子发芽率、发芽速度，又能反映生长活力。这些指标能够从不同角度反映出水稻苗期耐镉性的强弱[33-35]。低Cd浓度（0.01 mg·L-1）增加了华润2号和深两优5814两个水稻品种的种子发芽率、发芽指数和活力指数，同时华润2号胁迫指数表现为促进作用；高浓度Cd胁迫（0.1 mg·L-1）可以降低两种水稻的发芽率耐性系数，胁迫指数显著增大（表 4、表 5）。出现这种低促高抑现象的原因可能是低浓度Cd提高胚的生理活性，从而促进种子萌发，高浓度Cd使得种子中淀粉酶和蛋白酶活性受到抑制，种子萌发和幼苗生长中物质和能量供应不足，抑制种子的正常萌发和幼苗生长[36-37]。另外，已有研究表明，Cd胁迫下植物细胞中DNA和RNA活性降低，核酸含量下降，有丝分裂过程受阻，从而影响种子发芽过程[38]。高浓度Cd胁迫对两个水稻品种的耐性系数和胁迫指数大小均表现为华润2号＞深两优5814，这也表明Cd胁迫对不同品种水稻种子萌发的影响有差异，不同水稻品种的Cd耐性差异很大[39]。目前认为植物的耐Cd途径主要有限制Cd吸收、螯合沉淀和区域化作用[40]。邬飞波等[41]研究表明植物对重金属的耐性和积累在种间和基因型之间存在差异，在重金属胁迫下植物螯合态合成是植物对胁迫的一种适应性反应，耐性基因型合成较多的植物螯合态，植物螯合态可与重金属螯合，进一步转运至液泡贮存，从而达到解毒效果。深两优5814在0.1 mg·L-1Cd胁迫下种子发芽率和发芽指数均高于华润2号，同时幼苗培养中Chl a、Chl b以及株高、根长等都高于华润2号（表 6、表 7），可能是因为深两优5814是低积累Cd品种，幼苗培养后各部位Cd含量均远小于华润2号（图 2）。
本实验中Cd胁迫下添加Delftia sp. B9菌液能提高水稻幼苗的叶绿素含量，增加植株株高，并能显著减少水稻植株各部位Cd含量，可能是由于菌株对Cd2+的吸附，Delftia sp. B9对Cd2+具有较高的耐性和吸附能力[11]，从而减少了Cd2+对水稻幼苗的胁迫，同时减少水稻幼苗对Cd2+的吸收和积累；另外，Delftia sp.能产生与植物促生菌（PGP）相关的代谢产物，如铁载体及IAA等促生物质，这些促生物质能促进植物生长，同时减少植物对Cd2+的吸收，减缓Cd对植物的胁迫。陆仲烟等[42]研究发现，Cd胁迫浓度在10 mg·L-1时接种伯克氏菌能显著提高水稻种子的活力指数、耐性系数和根系鲜质量。王立等[43]发现接种丛枝菌根真菌显著减轻Cd胁迫对水稻生长的抑制程度，水稻株高比对照组增加10%~13%。植物促生菌对植物生长发育有积极的影响，不仅为植物提供营养物质，固氮、溶磷、溶铁，并产生植物激素，还能提高植物抗逆性，抵抗致病生物体的感染[18, 44]。庞海东等[45]、杨丽等[46]的研究表明，促生菌产生的IAA和铁载体可以促进植物生长、提高植物对重金属的耐受性。铁载体不仅具有运输铁离子的作用，还可以与多种重金属离子进行络合，形成稳定的络合物，降低环境中重金属离子的浓度。Piotrowska-Niczyporuk等[47]研究发现IAA能够通过抑制重金属吸附来恢复植物的生长，缓解重金属对植物的毒害。经试验测定，Delftia sp. B9菌液能产生56.08 mg·L-1IAA，是一株高产铁载体的细菌（表 3），高浓度Cd胁迫会显著降低Delftia sp. B9产铁载体和产IAA的能力。添加不同浓度的Delftia sp. B9菌液对水稻种子萌发影响不同（图 1），高浓度菌液会抑制水稻种子萌发，这可能是由于菌液浓度过高产生某些有害的中间代谢产物，抑制了种子萌发。稀释后低浓度的菌液对种子萌发无抑制作用，也没有显著的促进作用，但能显著增加水稻株高和叶绿素含量。Morel等[44]研究表明，接种Delftia sp.JD2虽然不能增加苜蓿的苗产量，但能促进其根系的发育，同时能够增加4%~5%的作物产量。低浓度Cd胁迫下添加菌液没有增加种子的发芽率，这可能是因为菌液对Cd进行吸附使Cd浓度降低，减少了低浓度Cd对水稻种子萌发的促进作用；高浓度Cd胁迫下添加菌液比不添加的处理水稻种子的发芽率显著提高，可能是菌液对Cd进行吸附使Cd浓度降低，缓解了对种子的毒害，也可能是菌液产生铁载体降低了水稻种子对Cd的吸收。
4 结论（1）Cd胁迫浓度为0.1 mg·L-1时，添加Delftia sp. B9菌液可以提高水稻华润2号、深两优5814种子发芽率、活力指数和耐性系数，耐性系数分别显著增加0.19、0.32。
（2）Cd胁迫浓度为0.1 mg·L-1时，添加Delftia sp. B9菌液的处理能使两种水稻幼苗的Chl a含量分别增加2.29、2.98 mg·g-1，Chl b含量分别增加1.51、0.99 mg·g-1，植株株高分别增加5.76、4.34 cm。
（3）Cd胁迫浓度为0.1 mg·L-1时，添加Delftia sp. B9菌液的处理使华润2号根、茎、叶中Cd含量分别降低63.81%、67.59%、70.84%，深两优5814根、茎、叶中Cd含量分别降低75.95%、74.84%、80.81%。
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