2021, Vol. 40
2. 海南省农林环境过程与生态调控重点实验室, 海口 570100;
3. 墣锦环境工程(海南) 有限公司, 海口 570105
2. Key Laboratory of Agro-Forestry Environmental Processes and Ecological Regulation of Hainan Province, Haikou 570100, China;
3. Pujin Environmental Engineering(Hainan) Co. Ltd, Haikou 570105, China
近年来，新型污染物微塑料引起了全球的广泛关注[1-3]。据统计，土壤中的微塑料污染十分普遍，其丰度可能是海洋中的4~23倍[1, 4]。其中，农业生产过程因大量使用农用塑料薄膜、有机肥等农资，或通过污水灌溉、大气沉降等途径而导致农田土壤中积累的微塑料含量远高于海洋[5-10]。有研究报道我国经有机肥施用进入农田土壤的微塑料含量高达52.4~26 400.0 t[1]。上海郊区农田土壤中微塑料残留达（78.00 ± 12.91）个·kg-1土（0~3 cm土层）和（62.50±12.97）个· kg-1土（3~6 cm土层）[11]。由此，土壤生态系统被认为是受微塑料污染最为严重的陆地生态系统[12-13]，微塑料污染可能成为陆地生态系统的新威胁[14-15]。
农业生态系统中的微塑料可造成土壤质地和结构的物理化学变化（如增加孔隙率、改变团粒结构），改变生物物理环境，从而影响生物适应性和土壤功能，降低土壤生物多样性及其功能多样性，并对陆地系统的水循环和生态系统功能以及土壤生物的多样性产生影响[16-19]。当微塑料对土壤中植物营养元素的循环过程产生一定扰动时，植物种子萌发及生长特性也可能随之受到影响[5, 7, 20-21]。如连加攀等[5]发现，乙烯-乙酸乙烯酯共聚合物（EVA）、低密度聚乙烯（LDPE）和聚甲基丙烯酸甲酯（PMMA）会不同程度地影响小麦种子的发芽和幼苗生长。在物理特性上，微塑料在环境中可进一步降解成纳米级塑料甚至更小的颗粒，使其比表面积增大，成为更有效的污染物吸附剂和载体，并对动物和人类健康构成威胁[4]。此外，（微）塑料容易在环境中发生老化，在湍流、盐度和紫外线辐射等外部作用下，其表面电荷、粗糙度、孔隙度、极性和疏水性都会增加，这些特性使其成为从环境中吸收更多污染物如重金属、持久性有机污染物（POPs）等的完美载体[6-7]。付东东等[8]研究了微米级聚苯乙烯对铜的吸附特性，结果表明其对铜有一定的吸附能力。杨杰等[22]研究了微塑料对四环素的吸附，结果表明不同种类的微塑料（如聚苯乙烯、聚酰胺和聚乙烯等）对四环素均有一定的吸附能力。
除微塑料污染之外，我国土壤同时面临较为严重的重金属污染，其中镉较为常见[23]。调查表明，土壤中镉的含量远高于背景值，我国镉污染耕地面积达1 300万hm2，多地区农田在一定程度上受到污染[24-26]。镉易被植物吸收并累积，影响人类对土壤的长期利用和作物种植安全，甚至可通过食物链最终威胁人类健康[23, 26-27]。
水稻是我国的主要粮食作物，全国60%以上的人口以稻米为主食[28]。有关重金属对水稻种子萌发的影响已有较多研究，但针对新型污染物微塑料与重金属复合污染对水稻种子萌发特性的影响尚未见报道。土壤中可能同时存在微塑料和重金属镉，二者极可能会发生不同的交互作用。因此，本文采用水稻作为供试植物，以重金属镉和两种典型微塑料——聚苯乙烯（mPS）与聚对苯二甲酸类塑料（mPET）为研究对象，主要研究其单一及复合污染对水稻种子萌发特性的影响，旨在探讨共存污染物对农作物的生态效应，为后期评估微塑料污染对作物的生态毒理效应提供理论依据。
1 材料与方法 1.1 供试材料供试水稻为Y两优900（国审稻2016044，实测发芽率为95%）。过氧化氢（H2O2，30%）和氯化镉（CdCl2·2.5H2O）均为分析纯。实验中所用塑料聚苯乙烯（PS）购买于上海阿拉丁生化科技股份有限公司（CAS号：9003-53-6），聚对苯二甲酸乙二醇酯（PET）购买于No.8863华润（中国常州）。两种塑料颗粒经液氮冷冻干燥后由高速破碎机研磨成粒径为200~ 300 μm的微塑料mPS和mPET。经扫描电子显微镜（图 1）可见，微塑料粒径分布较为均匀。
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图 1 微塑料mPS和mPET的SEM图 Figure 1 Scanning electron microscopy(SEM)of mPS and mPET |
采用1.5% H2O2溶液浸泡健康饱满的参试水稻种子20 min，去离子水反复冲洗并浸泡6 h后将种子沥干备用。将20粒水稻种子整齐摆放于铺有两层滤纸的培养皿（直径为9 cm）中。本研究主要参考了连加攀等[5]研究中设置的微塑料浓度，同时结合前期预实验结果，设置了单一和复合实验中的外加微塑料量。镉暴露浓度参考陈杰[28]的研究，并结合前期预实验结果进行设置。具体操作中，将定量微塑料撒在滤纸上，尽量使其分布均匀，使水稻种子受到的暴露一致。
单一污染实验：在上述培养皿中分别加入5 mL浓度为100、300、500、1 000 mg·L-1和1 500 mg·L-1的微塑料（mPS和mPET）悬浮液；2、5、10 mg·L-1和50 mg·L-1镉溶液。所有处理设置3次重复。
复合污染实验：基于上述单一污染实验结果，在培养皿中分别加入5 mL mPS和mPET（100 mg·L-1和500 mg·L-1）及镉（2 mg·L-1和10 mg·L-1）的复合溶液，所有处理设置3次重复，探究二者复合对水稻种子发芽的影响。
对照组：用等量的去离子水培养，所有处理设置3次重复。
将处理好的培养皿置于生化培养箱（型号LRH- 150），在25 ℃的条件下培养7 d。培养过程中，每日记录小麦种子萌发情况，并加入适量的去离子水以补偿蒸发的水分，保持培养液的浓度不变。补充的水量根据预实验阶段的结果确定，大致为：在未加滤纸和种子的情况下，向培养皿中加入5 mL去离子水，盖上盖，在与处理组实验条件相同的情况下，每隔24 h测定培养皿中剩余水的体积，间接计算出每日的蒸发水分量，约0.3~0.5 mL。
1.3 测定方法以幼芽达到种子长度一半，根长与种子等长作为发芽标准，第7 d统计发芽率、平均胚根长和胚芽长。胚根长度与胚芽长度用1/10 cm尺子人工测量。发芽率、发芽势、发芽指数和活力指数等指标的计算公式如下：
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(2) |
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(3) |
式中：Gt为t d内的发芽数；Dt为对应的发芽天数，d。
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(4) |
实验结果均以平均值±标准偏差（Mean±SD）表示，采用Excel 2010对数据进行处理，采用SPSS 23.0对数据进行统计分析，其中，单一实验采用单因素ANOVA检验分析，复合实验采用双因素方差分析。
采用计算生长净变化量（ΔI）[29]的方法来判断微塑料和镉对水稻种子萌发的联合作用：
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(5) |
式中：IMPs+Cd、ICd、IMPs和ICK为微塑料与镉复合、单独加入镉和单独加入微塑料以及空白对照的生长变化。ΔI=0，微塑料与镉之间无交互作用；ΔI>0，微塑料与镉之间存在拮抗作用；ΔI < 0，微塑料与镉之间存在协同作用。
2 结果与分析 2.1 单一微塑料对水稻种子发芽的影响 2.1.1 单一微塑料对水稻种子发芽率的影响发芽率是衡量种子在污染物胁迫下萌发能力强弱的重要指标。在微塑料暴露下，水稻种子的发芽率为86.7%~96.7%（图 2），表明大部分水稻种子在微塑料影响下仍可以萌发，但不同的微塑料对水稻种子发芽的影响有所差异。在mPS暴露下，水稻种子的发芽率基本表现为低促高抑的规律（图 2a），即mPS浓度较低时（100 mg·L-1和300 mg·L-1）对水稻种子的发芽有所促进，浓度较高时（>300 mg·L-1）对水稻种子的发芽表现出一定的抑制作用。值得注意的是，与500 mg·L-1和1 500 mg·L-1的mPS相比较，1 000 mg·L-1 mPS对水稻种子的抑制作用减弱，发芽率与空白对照组相同。相比而言，mPET对水稻种子发芽率的影响为低促中抑高恢复（图 2b）。浓度为100 mg·L-1（低浓度）时，mPET促进了水稻种子的发芽；浓度为300 mg·L-1时，对水稻种子的发芽几乎无影响，发芽率与空白对照组相同；浓度升高至500 mg·L-1和1 000 mg·L-1（中浓度）时，水稻种子的发芽受到抑制；然而当浓度为1 500 mg·L-1（高浓度）时，mPET对水稻种子的抑制作用消失，甚至出现发芽率高于空白对照组的现象。
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图 2 微塑料mPS和mPET暴露下水稻种子发芽率随时间的变化 Figure 2 Effects of mPS and mPET on seeds germination rate of rice |
mPS处理对水稻种子发芽势的影响基本表现为抑制作用（表 1），各处理间差异不显著（P>0.05）。mPS浓度为500 mg·L-1时，对水稻种子发芽势的抑制作用最大。mPS处理对水稻种子发芽指数的影响基本表现为低促高抑的规律（表 1），即低浓度（100 mg·L-1）促进，中、高浓度（300、500、1 000 mg·L-1和1 500 mg·L-1）抑制，其中1 500 mg·L-1的mPS的抑制作用显著（P < 0.05）。mPS处理对水稻种子活力指数的影响基本表现为促进作用，在浓度为1 000 mg·L-1时，促进作用显著（P < 0.05）。
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表 1 单一微塑料及重金属镉对水稻种子生长特征的影响 Table 1 Effects of single MPs (mPS, mPET)and Cd on seeds growth characteristics of rice |
相比而言，mPET处理对水稻种子发芽势的影响基本表现为抑制作用（表 1），仅1 500 mg·L-1时表现为促进作用，但促进作用较弱，各处理间差异不显著（P>0.05）。与对照组相比，mPET处理对水稻种子发芽指数的影响基本表现为低促中抑高恢复的规律，即低浓度（100 mg·L-1）促进，中浓度（300、500 mg·L-1和1 000 mg·L-1）抑制，高浓度（1 500 mg·L-1）促进作用恢复，但与对照组相比差异均不显著（P>0.05）。mPET处理对水稻种子活力指数的影响基本表现为促进作用，在浓度为1 500 mg·L-1时，促进作用显著（P < 0.05）。然而，500 mg·L-1的mPET对水稻种子活力指数的影响表现为抑制作用。在微塑料暴露时，对水稻种子生长特性的影响结论不一，与对照组相比，处理组mPS（1 000 mg·L-1）和mPET（1 500 mg·L-1）显著地增强了处理组中水稻种子的活力指数（P < 0.05)，而这两个处理在对水稻中的发芽势和发芽指数上分别表现出不显著地抑制或促进作用（表 1）。
2.1.3 单一微塑料对水稻种子根长和芽长的影响由图 3a可知，mPS和mPET对水稻芽的生长均起促进作用，具体表现为微塑料高浓度（1 000 mg·L-1和1 500 mg·L-1）和低浓度（100 mg·L-1）时，促进作用较强，中浓度（300 mg·L-1和500 mg·L-1）时，促进作用较弱。由图 3b可知，mPS和mPET对水稻根的生长影响基本表现为促进作用。有所不同的是，500 mg·L-1的mPET对水稻的根长有所抑制，但抑制作用较弱。总体来说，单一微塑料对水稻种子根和芽的生长影响相对较小。
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图 3 微塑料mPS和mPET对水稻芽长和根长的影响 Figure 3 Effects of microplastics mPS and mPET on bud length and root length of rice |
在镉胁迫下，随着镉浓度的升高，水稻种子的发芽率呈下降趋势（图 4）。镉胁迫对水稻种子发芽率的影响总体表现出低促高抑的规律，镉溶液浓度较低时（2 mg·L-1和5 mg·L-1），对发芽率起促进作用，当镉溶液浓度升高时（10 mg·L-1和50 mg·L-1）则抑制发芽率。2.2.2单一镉对水稻种子生长特性的影响
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图 4 镉胁迫下水稻种子发芽率随时间的变化 Figure 4 Effects of Cd on germination rate of rice seeds |
镉污染对水稻种子的生长特性指标（发芽势、发芽指数及活力指数）基本表现为低促高抑的规律（表 1），但具体表现有所差异。镉浓度为2 mg·L-1和5 mg·L-1时，对水稻种子的生长特征指标均表现为促进作用。当镉浓度增加至10 mg·L-1和50 mg·L-1时，对水稻种子的发芽势和发芽指数均表现出抑制作用，而10 mg·L-1的镉对水稻种子的活力指数表现为促进作用。由表 1可知，随着镉胁迫浓度的升高，水稻种子的生长特征指标均呈现出下降趋势。与对照组相比，镉胁迫浓度在2 mg · L-1和50 mg · L-1时差异显著（P < 0.05）。
2.2.3 单一镉对水稻芽长和根长的影响单一镉对水稻芽生长的影响表现为低促高抑的规律（图 5），低浓度（2、5 mg·L-1和10 mg·L-1）促进芽的生长，高浓度（50 mg·L-1）抑制芽的生长。与对照组相比，促进作用和抑制作用均不显著（P>0.05）
单一镉对水稻根生长的影响也表现为低促高抑的规律（图 5），低浓度（2 mg·L-1和5 mg·L-1）促进根的生长，浓度为10 mg·L-1时不影响根的生长，高浓度（50 mg·L-1）显著抑制根的生长。
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图 5 重金属镉对水稻根长和芽长的影响 Figure 5 Effects of heavy metal cadmium on root and bud length of rice |
低浓度mPET与镉的复合作用促进了水稻种子的发芽，较高浓度mPET与镉的复合作用几乎不影响水稻种子的发芽（图 6a）。镉浓度一定时，mPET浓度升高，对发芽率的促进作用减弱，即100 mg·L-1的mPET与镉溶液（2 mg·L-1和10 mg·L-1）的复合作用促进水稻种子发芽；500 mg·L-1的mPET与镉溶液（2 mg·L-1和10 mg·L-1）的复合作用几乎不影响水稻种子的发芽。
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图 6 微塑料-镉复合效应下水稻种子发芽率随时间的变化 Figure 6 Combined effects of MPs-Cd on seed germination rate of rice |
低浓度镉溶液与mPS的复合作用对水稻种子的发芽有所抑制，但抑制作用较小，较高浓度镉与mPS的复合作用对水稻种子的发芽几乎无影响（图 6b）。mPS浓度一定时，镉浓度升高，对发芽率的抑制作用减弱，即2 mg·L-1的镉溶液与mPS（100 mg·L-1和500 mg·L-1）的复合作用抑制水稻种子的发芽；10 mg·L-1的镉溶液与mPS（100 mg·L-1和500 mg·L-1）的复合作用对水稻种子的发芽无明显影响，发芽率与对照组相近。
2.3.2 微塑料-镉复合对水稻种子生长特性的影响由表 2可知，微塑料-镉的复合效应对水稻种子的发芽指数和活力指数的影响均表现为促进作用，且对活力指数的促进作用显著（P < 0.05）。微塑料-镉的复合效应对水稻种子发芽势的影响基本表现为促进作用，仅10 mg·L-1的镉溶液和500 mg·L-1的mPS、2 mg· L-1的镉溶液和500 mg·L-1的mPS的复合作用对水稻种子的发芽势起抑制作用。对比单一污染物胁迫，高浓度微塑料（500 mg·L-1）与镉的复合效应对水稻种子生长特征的影响基本表现为拮抗作用，如对发芽势均表现为拮抗作用，这表明在两种污染物（微塑料-镉复合）胁迫下，水稻种子的发芽率比单一（微塑料或镉）污染胁迫下高，对水稻种子的影响降低。低浓度微塑料（100 mg·L-1）与低浓度镉（2 mg·L-1）的复合效应对水稻种子的发芽指数为协同作用，即低浓度微塑料会增强低浓度镉对水稻种子发芽的抑制作用。
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表 2 微塑料-镉复合污染对水稻种子生长特征的交互作用 Table 2 Combined effects of MPs and Cd on growth characteristics of rice seeds |
由表 3可知，微塑料-镉复合效应能够显著促进水稻芽的生长（P < 0.05），且不同处理下，对芽的生长的促进作用差异不大。微塑料-镉复合效应对水稻根生长的影响几乎表现为促进作用。对比单一污染物，低浓度的mPS（100 mg·L-1）与低浓度的镉溶液对根和芽的生长为协同作用，这与表 2中低浓度微塑料与低浓度镉对水稻种子的协同作用相似。低浓度（100 mg·L-1）的mPET与高浓度（10 mg·L-1）的镉溶液的复合效应也为协同作用。根生长受到的复合影响比芽大。
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表 3 微塑料-镉复合污染对水稻种子根长和芽长的交互作用 Table 3 Combined effects of MPs and Cd on root length and bud length of rice seeds |
发芽率、发芽势、发芽指数等是衡量农作物种子发芽能力的重要指标，活力指数是反映农作物种子品质的重要参数[30-31]。镉胁迫对水稻种子的萌发具有不同程度的影响。根据陈杰[28]的研究，低浓度镉对水稻种子的萌发有促进作用，高浓度镉会影响水稻种子的发芽率，且随镉浓度增加，抑制作用增强；镉对水稻幼根生长的影响，在低浓度下即表现为抑制作用，根长随镉浓度的增加而递减。闫静等[32]研究指出，镉对根生长的影响要大于芽。本研究结果表明，镉对水稻种子萌发特性的影响基本表现为低促高抑，且随着镉浓度的升高，各项指标均呈现下降的趋势。镉浓度较高时，其能显著抑制根的生长，此结论与前人的研究结果基本吻合。
当前，农业生态系统中微塑料与作物之间相互作用的研究较少，微塑料对植物的作用机理尚不清晰[5, 7, 13]。本研究发现mPS和mPET在低浓度时对水稻种子的发芽起促进作用，中浓度起抑制作用，高浓度抑制作用减弱，或无影响甚至是促进作用。刘蓥蓥等[9]研究了聚乙烯微塑料对绿豆发芽的毒性效果，指出聚乙烯微塑料的植物毒性与粒径和浓度密切相关，粒径越小、浓度越高，其植物毒性可能越强。微塑料本身所带的电荷和粒径可能会影响水稻种子对微塑料的吸收和吸附[6, 33]。低中浓度下粒径可能是影响微塑料生物效应的主要原因，微塑料粒径变小，其比表面积增大，可能更利于水稻对微塑料的吸附[5, 9]。当微塑料的浓度较高时，其容易发生团聚，导致溶液中游离态微塑料浓度减小，即实际发挥作用的浓度降低，从而减弱对水稻种子发芽率的抑制，甚至无影响以及起到促进作用[6, 34]。团聚后，微塑料的粒径会阻碍吸附，从而降低水稻种子对微塑料的可接触性，减轻发芽胁迫[5]。与对照组相比，微塑料对水稻种子的根长和芽长均起一定的促进作用，表明一定量的微塑料有助于水稻种子的生长，与连加攀等[5]和刘蓥蓥等[9]的研究相比有所不同，可能是由微塑料种类和粒径的差异所造成的。与镉相比较，微塑料对水稻种子生长的影响较小。
在研究微塑料与重金属的联合作用时，考虑到不同条件下微塑料对重金属的吸附量不同，故在前期工作中先测定了微塑料mPS对镉的吸附量变化（暂未发表）。实验结果表明，在吸附动力学实验中，称取0.02 g的mPS于50 mL聚乙烯离心管中，再加入20 mL浓度为1 mg·L-1的镉溶液，结果表明：mPS对镉离子的平衡吸附量为0.185 mg·g-1，吸附开始5 h内为快速吸附阶段，5~24 h为缓慢吸附阶段，24~48 h逐渐达到吸附平衡。在吸附等温线实验中，称取0.02 g的mPS于50 mL聚乙烯离心管中，加入20 mL浓度为0.1、0.3、0.5、1、1.5、2 mg·L-1的镉溶液，结果表明：镉离子在mPS上的吸附等温线为非线性，微塑料的吸附量随着镉浓度的升高而增加。
在上述实验基础上，本文设置的复合实验中选取的微塑料浓度为100 mg·L-1（对水稻种子的发芽起促进作用）和500 mg·L-1（有较弱的抑制作用），镉浓度为2 mg·L-1（促进作用）和10 mg·L-1（抑制作用，但抑制作用较弱）。100 mg·L-1 mPET与镉溶液（2 mg·L-1和10 mg·L-1）复合对水稻种子的发芽率起促进作用，且高于单一微塑料或单一镉作用下的发芽率，属于协同作用。2 mg·L-1镉溶液与mPS（100 mg·L-1和500 mg·L-1）的复合作用对水稻种子的发芽率起抑制作用，且低于单一微塑料或单一镉作用下的发芽率，属于拮抗作用。将mPS-镉的复合与mPET-镉的复合相比较可知，mPS-镉的复合作用对水稻萌发的毒性更小。在微塑料-镉的复合效应下，水稻种子发芽指数、发芽势和活力指数等参数高于微塑料或镉的单一效应下的参数，属于协同作用。
由此可知，不同种类、不同浓度的微塑料与不同浓度的重金属溶液的复合作用存在较大差异。微塑料可以通过吸附作用富集金属离子，微塑料与污染物联合作用于生物体时，会通过增加摄入浓度、加剧组织损伤和降低机体抗性等方式增强污染物对生物体的毒性效应[35]，即抑制水稻种子的发芽，如2 mg·L-1的镉溶液与mPS（100 mg·L-1和500 mg·L-1）的复合可能损害了水稻种子某些组织，从而导致发芽受到抑制。此外，微塑料也可通过降低污染物接触浓度、污染物或共污染物的生物可利用性减缓污染物对生物体的毒性效应[35]，即促进水稻种子的发芽。如本研究中的实验组合100 mg·L-1的mPET和mPS与2 mg·L-1镉溶液，相比单一污染物浓度下，该组合发生协同作用，反而促进了种子发芽。微塑料和镉的复合效应对水稻种子的根长和芽长均表现出较为显著的促进作用，对比单一污染物，低浓度的微塑料与镉的复合对种子的芽和根生长大体表现为协同作用，可能是因为微塑料与镉的复合浓度较低。不同种类的微塑料对镉的吸附能力具有差异，且对不同浓度镉的吸附能力不同[36]，因此推断微塑料与镉联合作用对植物的作用机理差异较大，还有待进一步研究。
在自然环境中，由于不同种类的污染物同时存在，它们之间存在着复杂的交互作用（如协同作用、拮抗作用或其他），另外环境条件也是多种多样，微塑料对污染物吸附行为的研究需要进一步综合考虑生物膜等生物因素以及温度和盐度等非生物因素、微塑料物理性质（粒径大小、表面形态和颜色等）和化学性质（络合物和浓度等）[37]。此外，微塑料在环境中容易老化，导致其理化性质发生明显变化，从而产生更为严重的毒理现象[38]。因此，微塑料与其他污染物的联合毒性效应和机制尚不明确，需要对它们相互作用行为以及评价方法作进一步研究。
4 结论（1）在本实验浓度范围内，单一微塑料处理对水稻种子发芽势的影响基本表现为抑制作用，对发芽指数基本表现为低促高抑的规律，对活力指数、根长和芽长的影响基本表现为促进作用。
（2）镉胁迫对水稻种子的发芽势、发芽指数和活力指数基本表现为低促高抑的规律，但对水稻种子的抑制率高于单一微塑料。
（3）与对照组相比，低浓度mPET（100 mg·L-1）-镉复合促进水稻种子的发芽，mPS-低浓度镉（2 mg· L-1）复合抑制其发芽，其他复合作用对水稻种子发芽率几乎无影响。微塑料-镉复合效应对水稻种子生长特性、根长和芽长的影响总体表现为促进作用。
（4）与单一微塑料或镉作用相比，低浓度微塑料（100 mg·L-1）和低浓度镉（2 mg·L-1）复合对种子发芽的影响表现为协同作用，高浓度微塑料（500 mg·L-1）与镉复合均表现为拮抗作用。微塑料-镉复合效应对水稻种子生长特性、根长和芽长的影响总体表现出一定的拮抗作用。
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