2021, Vol. 40
2. 西北农林科技大学资源环境学院, 陕西 杨凌 712100
2. College of Natural Resources and Environment, Northwest A&F University, Yangling 712100, China
塑料及其制品广泛应用于工业、农业和日常生活的各个领域，全球塑料产量在2015年就已经超过3亿t，预计到2035年塑料年产量将增加一倍[1-2]。其中，聚乙烯（PE）塑料被大规模生产，主要用于农业覆盖物、复合材料和包装用品[3]等多个方面。在农业领域，大量低密度PE薄膜被用于保护作物、抑制杂草、调节温度和保持土壤中的水分等，随着时间的推移，这些薄膜会变得易碎并被分解为微小颗粒[4]，即微塑料（MPs，直径小于5 mm）[3, 5]。这些微小颗粒会以空气作为载体，在土壤中富集。MPs所带来的危害不只来自于它本身（如：增塑剂长期暴露会引起生殖、呼吸、内分泌等多系统的损伤）[6-8]，更严重的是，MPs可以作为其他污染物的载体，如重金属、持久性有机污染物（POPs）、疏水性有机化学品（HOC）[9-11]等。
多环芳烃（Polycyclic aromatic hydrocarbons，PAHs）作为一类持久性有机污染物广泛存在于自然界中，微生物代谢是降解环境中PAHs等有机污染物的重要手段[12]。融合菌株F14是以菲降解菌Sphingomonas sp. GY2B和芘降解菌Pseudomomas sp. GP3A为亲本，通过原生质体融合技术构建的一株高效降解PAHs的降解菌。该菌具备比亲本更广的温度（20~40 ℃）和pH（6.5~9）适应范围，更高效的PAHs降解性能，而且具有和亲本GY2B不同的菲降解途径，F14具有两条菲代谢途径并且在降解过程中较少积累有毒中间代谢产物。F14可以在30 d将土壤中初始浓度为10 mg·L-1和50 mg·L-1的菲降解89.9%和73%，并可以耐受100 mg·L-1的菲[13]。然而，这些数据都是在实验室条件下得到的，如果将融合菌株F14应用到实际环境中，环境中微塑料的存在是否会影响F14对PAHs的降解，是否会威胁或有助于F14的生存，这都需要进一步的研究。
目前，对环境中微塑料的研究主要集中在分布[14-15]、吸附降解[16]、生物及群落[17]的影响等方面，涉及对微生物个体影响的研究[2, 18]相对较少。因此，本研究以聚乙烯微塑料（PE-MPs）为研究对象，探究受微塑料影响前后F14细胞的表面形态、胞外聚合物（Extracellular polymeric substances，EPS）化学成分变化及细胞内活性氧（Reactive oxygen species，ROS）含量，考察在降解菲过程中微塑料对F14的影响，为进一步评价融合菌株F14在实际PAHs土壤污染场地修复中的潜在应用提供科学依据和理论基础。
1 材料与方法 1.1 试验材料研究所使用的菲（98%）、甲醇（色谱纯）、正己烷（分析纯）、PE-MPs（粒径为500 μm和1 mm）等试剂，均购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；营养肉汤购自广东环凯微生物科技有限公司。每次试验前须将PE-MPs置于超净台中进行紫外灭菌处理。
无机盐基础培养液（MSM）：分别取5 mL磷酸盐缓冲液（KH2PO4 8.5 g·L-1，K2HPO4·H2O 21.75 g·L-1，Na2HPO4·12H2O 33.4 g·L-1，NH4Cl 5.0 g·L-1，3 mL MgSO4水溶液22.5 g·L-1，1 mL CaCl2水溶液36.4 g·L-1，1 mL FeCl3水溶液0.25 g·L-1）和1 mL微量元素[MnSO4·H2O 39.9 mg·L-1，ZnSO4·H2O 42.8 mg·L-1，（NH4）6Mo7O24·4H2O 34.7 mg·L-1]并定容至1 L，调节pH为6.8~7.0，灭菌20 min后备用。
含有菲的无机盐培养液（100 mg·L-1）：在灭菌的三角瓶中加入适量的菲标准储备液（5 g·L-1，正己烷为溶剂配制），待正己烷挥发完毕，加入灭菌后的MSM。
1.2 PE-MPs对F14降解菲的影响在含有菲的MSM培养基（20 mL）中仅加入菌液，不添加PE-MPs，设为对照组。在对照组的基础上分别加入粒径为500 μm、1 mm，浓度为20、40、80、160、320 mg·L-1的PE-MPs，设为试验组，如表 1所示。每个试验组均对应设置空白组（仅含有对应浓度和粒径的微塑料，不含菌株）。所有样品30 ℃避光振荡培养。添加不同质量浓度的PE-MPs，分别在第3、6、9、12、15、18、21、24、48、168 h取样测定菲的降解率，每组试验设置3个平行样。
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表 1 对照组及主要试验组编号 Table 1 Number of control groups and experimental groups |
在待测样品中加入适量的甲醇，超声处理整瓶萃取，用甲醇定容至50 mL。取1.5 mL溶液过0.22 μm有机滤膜后移入色谱瓶中，使用岛津（20A）高效液相色谱（HPLC）测定菲的剩余量，计算菲的降解率，计算公式如下：
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式中：A0表示相应空白组对应的峰面积；A表示对照组和试验组样品对应的峰面积。
1.4 扫描电镜（SEM）分析利用扫描电镜（SU8010，日立）观察PE-MPs存在情况下菌株细胞表面形态变化。离心收集（10 000 r·min-1，10 min）对照组、3c、3C、5c和5C试验组细胞样品，并将PE-MPs颗粒分出，单独观察PE-MPs表面生物膜的形成情况。剩余菌体则用于分析游离在培养基中的菌株的细胞形态变化。样品使用2.5%戊二醛完全浸没固定12 h后，用磷酸缓冲液漂洗，再用1%的锇酸溶液固定样品2 h，漂洗，接着用梯度浓度的乙醇溶液（30%、50%、70%、80%、90%和95%）对样品进行脱水处理，最后用乙醇与醋酸异戊酯混合液（V/V=1/1）处理样品30 min，再用醋酸异戊酯处理样品1 h，干燥，镀膜，观察。不含菌株的PE-MPs颗粒直接干燥，镀膜，观察。
1.5 傅里叶变换光谱（FTIR）分析离心收集（10 000 r·min-1，10 min）试验组4、试验组5和对照组细胞样品，冻干（-80 ℃），使用红外光谱仪（Nicolet Is10，Thermo Fisher）进行测试（KBr压片），分析F14细胞表面的主要成分变化。
1.6 细胞活性氧（ROS）测定离心收集（10 000 r·min-1，10 min）对照组和试验组24、48 h和168 h的细胞，采用ROS酶联免疫分析试剂盒进行测试。450 nm波长下用酶标仪测定吸光度（OD值）。通过标准曲线，计算样品中ROS浓度。
2 结果与讨论 2.1 PE-MPs对F14降解菲过程的影响添加不同粒径和不同质量浓度的PE-MPs后F14对菲的降解效果如图 1所示。从图中可以看出，在添加了不同浓度的500 μm和1 mm微塑料后F14对菲的降解趋势大体一致。24 h内，添加微塑料后F14对菲的降解率明显增高，且随着微塑料浓度增大，F14对菲的降解率也逐渐升高；48 h后，试验组和对照组的菲降解率均基本达到100%；168 h后，对照组和试验组中菲的降解率均达到100%。这表明PE-MPs在一定程度上促进了F14对菲的降解，可能是由于PEMPs为F14提供了载体，有利于其发挥更高的生理活性，同时也增加了F14和菲的接触机会[19]。此外，PEMPs表面分子的疏水性使得其与环境中的水分子之间存在界面，这种界面也可能为F14生物膜的形成提供了空间[20]。
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图 1 微塑料对F14菌株降解菲的影响 Figure 1 Effect of microplastics on the degradation of phenanthrene by F14 strain |
通过FTIR对添加PE-MPs前后培养体系中的F14菌株化学成分进行分析鉴定，结果如图 2所示。3 700~3 050 cm-1区间出现的峰是由羟基、羧基、酚羟基等O—H键和酰胺的N—H振动引起。位于2 930 cm-1处的峰是由C—H振动（脂质或蛋白质的CH2和CH3官能团）引起[21]。FTIR光谱中蛋白质特征峰主要是：位于1 640 cm-1处的酰胺Ⅰ带（1 700~1 600 cm-1），为C＝O伸缩振动；位于1 540 cm-1处的酰胺Ⅱ带（1 600~1 500 cm-1），是N—H弯曲振动和C—N拉伸振动的耦合产生[22]；1 450 cm-1处为蛋白质中的C—N键的吸收峰，且氨基在1 450~1 250 cm-1区域存在面内摇摆振动和面外摇摆振动两个峰。由图可以看出，对照组和试验组红外吸收的相对强度存在明显变化。图 2A至图 2D显示，培养的第24 h和48 h试验组对应的蛋白质的特征峰相对强度增强，这说明PE-MPs存在时F14菌株的生长代谢过程更加旺盛[23]。1 080 cm-1处吸收峰归属于核酸中PO2基团的特征峰[22]，试验组培养第24 h和48 h时，该吸收峰的相对强度增加，这说明PE-MPs的存在促进了F14菌株的核酸转录等过程，促进了F14的生长繁殖[24]。1 150~750 cm-1的峰归属于多糖[25]，多糖和蛋白质是EPS的关键成分，其源于细菌的分泌和表面黏附，细胞聚集和裂解等多种微生物生理过程[26-27]。第24 h和48 h测试结果显示，试验组多糖的相关特征峰相对强度明显增强，表明PE-MPs的存在会影响F14细胞EPS的分泌。
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图 2 与PE-MPs（80 mg·L-1和320 mg·L-1）培养前后细胞的红外光谱图 Figure 2 Infrared spectra of cells before and after PE-MPs(80 mg·L-1和320 mg·L-1)culture |
在培养的第24 h和48 h，试验组的蛋白质、核酸、多糖的相对含量明显增加，且320 mg·L-1试验组略高于80 mg·L-1；在第48 h，500 μm试验组相对含量略高于1 mm试验组。第168 h（图 2E和图 2F）的测试结果显示，试验组与对照组具有相当的蛋白质、核酸、多糖水平。这可能是由于在第24 h和48 h时，F14在PEMPs存在的环境下，应激产生了更多的EPS，在第48 h之后，由于培养基中的菲基本都被降解，同时，F14对PE-MPs的环境基本适应，致使试验组F14菌株的生长代谢过程放缓，保持正常水平，因此，第168 h时，试验组和对照组的红外测试结果基本相似。
2.3 PE-MPs对F14表面形态的影响添加PE-MPs前后F14表面形态的变化及PEMPs表面变化见图 3。结果显示，与对照组相比（图 3A），添加PE-MPs后细胞出现了凹陷现象，这可能是由于添加PE-MPs引起了细胞内外渗透压的变化[28]，进而造成了细胞表面形态的变化。同时也观察到细胞出现了丝状物。与未添加微生物的PE-MPs（图 3G）相比，添加了微生物的PE-MPs表面细胞分泌出更多的丝状物，结合FTIR结果推测其可能为微生物分泌的EPS，这些EPS将菌团聚在一起（图 3I），也将菌和微塑料连接在一起，使菌能够附着在微塑料上，这可能有利于微生物降解微塑料表面的菲。另外，从图中可以看到生物膜中丝状的生物膜基质，生物膜能为微生物生长提供一系列的有利条件，如有利于微生物对营养物质的吸收，并且能够帮助微生物抵御有毒物质和干燥环境[29-30]
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图 3 F14细胞（A-0c、B-5b、C-3c、D-3C、E-5c、F-5C）、MPs表面（G）及MPs表面生物膜（H、I）的SEM图 Figure 3 SEM micrographs of the F14 cell (A-0c, B-5b, C-3c, D-3C, E-5c, F-5C), the surface of MPs (G), and biological membrane formed on the surface of MPs(H, I) |
细胞中过量ROS的产生会降低细胞的生理活性，甚至导致细胞死亡[31]。因此，大量ROS产生是细胞氧化损伤的重要标志[32]。然而，少量的ROS会激发细胞的防御体系，减少损伤[33]。在不同浓度和粒径的PE-MPs存在下，F14在对菲降解过程中细胞内ROS的生成量结果如图 4所示。结果表明，在培养24、48 h和168 h后，试验组细胞内ROS水平均低于对照组。对于粒径为500 μm和1 mm的PE-MPs，随着其浓度的增加，F14细胞内ROS产生量基本呈降低趋势。随着培养时间的延长，试验组细胞ROS的产生量也有所下降。试验组细胞ROS的产生量主要与PE-MPs的浓度有关，粒径对细胞ROS的产生量没有明显的影响。PE-MPs的存在使得F14细胞ROS保持在较低水平，从而减弱了细胞自身的氧化损伤，使其能够保持较高的生理活性，促进其对菲的降解。同时，SEM与FTIR测试表明，EPS分泌量受PE-MPs的影响而增加。EPS是微生物正常生理过程产生的分泌物，可以形成细胞保护层[34-35]。当生存环境发生变化时，微生物的自我保护和生存机制将发挥作用，进而引起微生物EPS分泌量的波动[36-37]。因此，PE-MPs的存在可能对F14细胞产生了刺激作用，使其应激产生了更多的EPS，这有利于F14黏附于PE-MPs表面而生长。因此，F14菌株对于PE-MPs存在的环境具有较强的适应性。
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图 4 F14细胞ROS含量图 Figure 4 ROS content of F14 cells |
（1）试验粒径和浓度范围内PE-MPs的存在并没有抑制F14对菲的降解，反而促进了对菲的降解。PE-MPs的存在可能会使F14分泌更多的EPS并形成生物膜，进而有利于F14对菲的降解。
（2）PE-MPs的存在使F14菌株细胞ROS保持较低水平。随着PE-MPs浓度的增加和培养时间的延长，细胞ROS产生量逐渐降低。说明PE-MPs的存在可能会激发F14细胞的防御体系，减少F14细胞的氧化损伤，使其可以保持更高的生理活性，进而有利于对菲的降解。
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