邻苯二甲酸酯（Phthalate esters，PAEs）是一类用于增强产品稳定性、耐久性等的化学增塑剂和工业溶剂，多用于聚氯乙烯管、食品包装、医疗设备、儿童玩具、化妆品、黏合剂、杀虫剂和护理产品中。随着PAEs广泛用作增塑剂，其已成为遍布土壤、大气、水体和生物体中的污染物^[1-2]。邻苯二甲酸二（2-乙基己基）酯[Di-（2-ethylhexyl）phthalate，DEHP]是一种油性、低挥发性液体，在塑料制品中以非共价键的形式和高度疏水性维持自身的化学性质，当接触到亲脂性物质时，便会从塑料制品中逸出，进入环境中^[3]。研究表明，在空气、水体、土壤、城市污水、肉类、蔬菜等中均有DEHP检出^[4-5]，其最终会通过呼吸道、消化道和皮肤等途径暴露于人群^{[1, 4]}。DEHP作为毒性较大的一种环境内分泌干扰物，具有生殖毒性、免疫毒性、肝毒性及遗传毒性等^[6-8]。

研究表明，在人类和动物体内，DEHP会被肠腔中的胰脂肪酶迅速代谢为邻苯二甲酸单（2-乙基己基）酯[Mono-（2-ethylhexyl）phthalate，MEHP]^[9]，体内约67%的DEHP以MEHP的形式经尿液排出体外，因此MEHP可作为DEHP暴露水平的生物标志物^[10]。肝脏是体内重要的毒物代谢和转运器官，肝脏Ⅱ相代谢酶可与外来化合物结合，进行生物转化，降低化合物毒性，使外来化合物水溶性增加，便于排出体外。肝脏重要的Ⅱ相代谢酶有尿苷二磷酸葡萄糖醛酸转移酶（UDP-glucuronosyl transferases，UGT），其催化的葡糖醛酸化是重要的肝脏Ⅱ相反应机制之一，约占Ⅱ相新陈代谢的35%^[11]。UGT一共有4种类型，分别是UGT1、UGT2、UGT3和UGT8，其中UGT1能有效利用葡萄糖醛酸使外来化合物糖基化，增加化合物水溶性，更易于外来化合物通过尿液等途径排出体外^[12]。此外，主要的肝脏Ⅱ相代谢酶还包括谷胱甘肽硫转移酶（Glutathione S-transferase，GST），GST的主要作用有：催化各种亲脂性、亲电性代谢产物与还原型谷胱甘肽（Glutathione，GSH）结合反应生成亲水性代谢产物，加快各种外来化学物及其代谢产物排出体外；还可以减少氧化应激过程中产生的脂质过氧化物、胆固醇类过氧化物和脂肪酸类过氧化物，从而阻止氧化应激对细胞的进一步损伤^[13-15]。谷胱甘肽硫转移酶pi（Glutathione S-transferase pi，GST-pi）是GST的一种亚型，可催化GSH与化疗药物的结合，从而可以保护细胞免受化疗药物的损伤^[16]。

本研究在分析DEHP短期重复暴露对大鼠肝脏氧化指标影响的基础上，进一步探讨DEHP对肝脏Ⅱ相代谢酶的影响以及在血清、尿液中的代谢水平变化，研究结果不仅能丰富DEHP的基础毒性资料，也可为后续毒性机制、毒性干预等研究提供理论基础。

1 材料与方法 1.1 主要试剂与仪器

DEHP纯度99.5%（美国Sigma-Aldrich公司）；金龙鱼玉米油（市售）；考马斯亮蓝试剂盒、MDA试剂盒、SOD试剂盒、GSH-Px试剂盒（南京建成生物工程研究所）；大鼠UGT1试剂盒、GST试剂盒、GST-pi试剂盒（上海江莱生物科技有限公司）；三羟甲基氨基甲烷（Tris）（国药集团化学试剂有限公司）；其他试剂均为国产分析纯。配SPD-20A检测器的高效液相色谱仪LC-20A（日本岛津公司）；Enspire Xenon Light Module多功能酶标仪（美国Perkin Elmer公司）；Lynx 4000高速冷冻离心机（美国Thermo Fisher公司）。

1.2 试验方法 1.2.1 试验动物与分组

32只SPF级Sprague Dawley雄性大鼠，4~5周，体质量90~110 g，一批次购于广东省医学动物实验中心，试验动物合格证号：SCXK（粤）2013-0002。单笼饲养，适应性饲养一周后采用随机区组设计分组法^[17]按体质量分为4组，其中依据前人文献报道和DEHP大鼠经口急性毒性LD₅₀（30.6 g·kg^-1）设置低（300 mg·kg^-1）、中（1 000 mg·kg^-1）、高（3 000 mg·kg^-1）剂量组^[18]，另设对照组，每组8只，低中高剂量组灌胃1 mL DEHP玉米油溶液，对照组以等体积玉米油灌胃。饲养期间大鼠自由摄食、饮水，动物室温度22~24 ℃，相对湿度45%~55%。按照大鼠的生活习性，每日上午9：00灌胃，以经口灌胃的染毒方式，连续灌胃28 d，每4 d同一时间称大鼠的体质量及饲料消耗量，清洗水瓶并更换饮水，在第7、14、21、28 d上午9：00收集24 h大鼠尿液。处死大鼠前禁食12 h，继续保持自由饮水。末次染毒24 h后，大鼠断颈处死并迅速分离肝脏。

1.2.2 脏器系数

分离得到的32份大鼠肝脏分别用预冷的生理盐水冲洗，吸水纸吸干后称质量。脏器系数是脏器质量与大鼠体质量之比，计算公式如下：

1.2.3 血清制备

末次染毒24 h后，32只大鼠断颈处死并迅速采血完毕，将采血管分别轻轻颠倒3~5次，室温（20~ 25 ℃）静置30 min后，于4 ℃、3 000 r·min^-1离心15 min，待测。

1.2.4 肝匀浆制备

以肝脏质量∶体积=1∶9的比例加入适量PBS缓冲液，大鼠肝组织通过冷冻研磨仪进行匀浆，得到的匀浆液在4 ℃下2 000 r·min^-1离心20 min，上清液即为10%肝匀浆。

1.2.5 大鼠肝微粒体的制备

取新鲜肝脏，用预冷的PBS缓冲液（0.01 mol·L^-1）冲洗后，滤纸吸干，剪取1.5 g，按质量∶体积=1∶4的比例加入TMS缓冲液（Tris 3.025 g，MgCl₂ 0.304 5 g，蔗糖34.20 g，加蒸馏水溶解，HCl调节pH至7.40，蒸馏水再定容至500 mL），用冷冻研磨仪制备成肝匀浆，4 ℃高速离心机12 000 g离心20 min，小心吸取上清，按每毫升上清液加0.1 mL 88 mmol·L^-1 CaCl₂溶液，轻轻搅拌数次，置冰浴中5 min，再将混合液于4 ℃高速离心机27 000 g离心15 min，弃去上清，按每克肝组织所得微粒体沉淀重悬于5 mL 0.10 mol·L^-1 Tris溶液中（pH=7.40），用移液枪轻轻吹打，洗涤，除去杂蛋白和过量CaCl₂，在4 ℃高速离心机27 000 g离心15 min，所得沉淀为肝微粒体，上清液为肝胞液^[8]。

32只大鼠的肝匀浆、肝微粒体和肝胞液均采用考马斯亮蓝法定量总蛋白，蛋白标准品浓度为0.563 g prot·L^-1，严格按照试剂盒说明书检测SOD、GSH-Px、MDA、UGT1、GST和GST-pi。

1.2.6 大鼠尿液和血清中MEHP含量的测定

将32只大鼠的尿液分别置于10 mL EP离心管中，13 000 r·min^-1离心5 min，取1 mL上清液放入新的10 mL离心管中，加入250 μL醋酸铵溶液（1 mol·L^-1，pH=6.5）和20 μL β-葡糖醛苷酸酶（200 U·mL^-1），摇匀，超声3 min，37 ℃水浴酶解90 min。酶解处理后的样品中加入3 mL乙酸乙酯，在旋涡振荡器上充分振荡后，以4 000 r·min^-1离心5 min。吸取上层乙酸乙酯至10 mL离心管中，重复萃取3次。将萃取液合并后，45 ℃氮吹至近干，用乙腈复溶，0.22 μm微孔滤膜过滤后上机^[19]。

1.2.7 统计分析

以SPSS 23.0进行统计学分析，实验数据用x±s表示。多组间比较采用单因素方差分析，再进一步进行组间两两比较，若方差齐，采用LSD检验；若方差不齐，采用Tamhane′s检验，P < 0.05为差异显著，P < 0.01为差异极显著。

2 结果与分析 2.1 DEHP对大鼠体质量的影响

28 d染毒期内各组大鼠体质量均有所增长（图 1），3 000 mg·kg^-1组体质量在12 d后增速放缓，28 d时体质量显著低于其他各组。

2.2 DEHP对大鼠脏器系数的影响

各组大鼠肝脏脏器系数显著升高（P < 0.05）（图 2），且呈现剂量-效应关系。3 000 mg·kg^-1组肾脏脏器系数极显著高于其他各组（P < 0.01）。

2.3 DEHP对大鼠氧化系统的影响 2.3.1 血清中氧化指标的检测

300、1 000 mg·kg^-1组的SOD、GSH-Px活力和MDA含量与对照组差异不显著（P > 0.05）（表 1），3 000 mg·kg^-1组SOD、GSH-Px活力显著降低，MDA含量显著升高（P < 0.05）。

2.3.2 肝脏中氧化指标的检测

肝脏各处理组SOD、GSH-Px活力较对照组有下降趋势（表 2），3 000 mg·kg^-1组显著降低（P < 0.05）；3 000 mg·kg^-1组MDA含量极显著升高（P < 0.01）。

2.4 DEHP对肝微粒体中Ⅱ相酶UGT1、GST及GST-pi的影响

肝微粒体各处理组UGT1、GST-pi含量较对照组呈升高趋势（图 3），其中1 000、3 000 mg·kg^-1组UGT1含量极显著升高（P < 0.01）。与对照组相比，3 000 mg·kg^-1组GST含量极显著升高（P < 0.01）。染毒各组GST-pi含量均显著升高（P < 0.05）。

2.5 DEHP在体内的代谢情况 2.5.1 血清中MEHP含量

血清各组MEHP含量随染毒剂量加大而增加（图 4），对照组有微量检出，1 000、3 000 mg·kg^-1组MEHP含量较对照组极显著升高（P < 0.01）。

2.5.2 尿液中MEHP含量变化趋势

28 d染毒期内尿液各组MEHP含量先升高（图 5），在第7 d达到峰值，随后逐渐降低，在第28 d降到最低。在整个试验周期内，对照组尿液均有微量MEHP检出。

3 讨论

氧化应激反映了机体活性物质（包括活性氧和活性氮）产生和消除的不平衡，以及抗氧化剂产生的减少^[20]。SOD和GSH-Px是体内的主要抗氧化酶，它们可以通过清除自由基来保护细胞免受氧化应激的伤害。MDA是细胞中多不饱和脂肪酸过氧化的最终产物之一，其过量产生与自由基的增加有关，因此该指标可以反映机体组织内脂质过氧化的程度^[21-22]。在本研究中，大鼠体质量增长速度随着DEHP染毒剂量的增加而减缓，肝脏脏器系数却显著升高，与Li等^[23]的报道一致，说明DEHP会造成肝脏损伤，影响动物生长。高剂量的DEHP显著降低大鼠血清和肝脏中SOD、GSH-Px活力，增加MDA含量（P < 0.05）。这与Luo等^[24]的研究结果相似，Nrf2通路是细胞内重要的调节氧化还原反应的信号通路，可通过调节下游抗氧化酶的表达预防氧化应激，然而高剂量DEHP暴露会过表达Nrf2，导致Nrf2的持续积累，抑制Nrf2下游基因表达，阻断了Nrf2介导的氧化应激防御反应，从而提高ROS的含量。Nrf2下游基因表达被抑制，使抗氧化酶含量下降，ROS的升高增加了MDA的含量，引起大鼠体内的氧化应激和脂质过氧化，导致大鼠肝脏氧化损伤，并且染毒剂量越大，染毒时间越长，毒性作用越强，各项指标差异越显著，呈现明显的剂量-效应关系。

Ⅱ相代谢酶UGT1通过催化DEHP代谢产物MEHP在肝脏的葡萄糖醛酸化反应，改变其官能团，增加MEHP水溶性，使其便于从尿液等途径排出体外^[25-26]；GST、GST-pi均为受Nrf2信号通路调节的靶基因^[27]，其中GST可通过亲电性物质改变成亲水性物质，不仅有利于化合物从尿液排出，还保护组织免受氧化应激的损伤^[13-15]；而GST-pi是GST的一类亚型，可保护细胞免受化疗药物的损伤^[28]。在本研究中，随着DEHP染毒剂量的增加，大鼠肝脏的UGT1、GST、GST-pi含量总体呈现逐渐升高的趋势，在高剂量组中，UGT1、GST和GST-pi含量极显著升高（P < 0.01）。这说明来自DEHP的刺激诱导肝脏Ⅱ相代谢酶UGT1、GST、GST-pi的合成增加，提升其含量，从而促进大鼠肝脏加强对DEHP的解毒，使DEHP更容易从大鼠体内排出；GST含量的升高还意味着大鼠肝脏在抵抗DEHP诱导发生的氧化应激和脂质过氧化反应，减少肝脏的氧化损伤。

MEHP是DEHP在大鼠体内的代谢产物，其毒性是DEHP的10倍^[29]，在肝脏经过葡萄糖醛酸结合反应后随着尿液排出体外^[26]。在本研究中，大鼠尿液中MEHP含量在染毒第7 d时最高，并且染毒剂量越大，峰值越高，在第7 d之后，MEHP含量降低。这可能是由于大鼠受到DEHP的刺激后，肝脏开始应激性调节，加强解毒作用，促使MEHP经过葡萄糖醛酸化反应后通过尿液途径排出体外；在DEHP暴露28 d后，大鼠血清中的MEHP含量随染毒剂量加大而升高，且高剂量组的肾脏脏器系数极显著高于对照组（P < 0.01），反映出随着染毒时间的延长，肝脏虽然仍在代谢DEHP，生成代谢产物MEHP，但可能因为持续的染毒，导致肾脏排泄能力下降，使得肝脏代谢的MEHP蓄积在血液中，无法随尿液排出体外，进而使后期大鼠尿液中MEHP均有所减少。而本实验对照组大鼠也被检出少量MEHP，推测可能是因为对照组与各染毒组饲养在同一环境中，加上饮用水中也会有极微量DEHP^[2]，导致对照组不可避免地摄入DEHP。

4 结论

（1）DEHP有致大鼠肝脏氧化损伤的毒性。

（2）DEHP会诱导肝脏Ⅱ相代谢酶UGT1、GST和GST-pi含量升高，从而使得大鼠肝脏解毒作用反馈性增强。

（3）DEHP的代谢产物MEHP在尿液中的含量与DEHP染毒剂量呈剂量-效应关系，且均在染毒第7 d时达到最高值。