生物刺激修复是目前广为采用的土壤有机污染修复技术^[1-2]。石油污染土壤中由于外碳源的大量输入，造成氮磷营养相对缺乏，制约了土著微生物的代谢活性及其对石油烃的降解能力。向土壤中补充氮磷营养或添加调理剂是一种常用的生物刺激修复方式^[3-6]。一些研究对加入外源氮修复石油污染土壤进行了详细报道^[7-9]。所采用的氮源包括无机氮源NH₄Cl、KNO₃、NH₄NO₃、（NH₄）₂SO₄和有机氮源尿素CO（NH₂）₂等多种类型^[10-13]。研究认为，当土壤C/N/P接近100/10/1时，土壤微生物活性最好，对石油烃的去除能力最强^[14]。

微生物修复对石油烃的去除效果不仅与土壤pH值、湿度、养分、土壤微生物活性和数量有关，还与土壤污染时长有关^[15]。一些研究认为新污染土壤中存在的大量轻质烃具有较好的生物可利用性，容易被土壤微生物降解代谢。然而，也有研究认为在新污染土壤中，降解菌数量少且活性低，石油污染使得土壤土著微生物处于“扰动期”，菌群结构的不稳定降低了石油烃的生物去除效率^[16-18]。陈旧性污染土壤中存在的稳定菌群和数量较多的功能降解菌有利于石油烃的去除，但老化石油烃可能会被土壤有机质吸附锁定，导致其生物可利用性变差^[19-21]。

我们在前期研究中发现，向陕北采油区污染土壤中加入有机肥可有效去除土壤中的石油烃。通过对比几种无机氮源发现，KNO₃对污染土壤中石油烃的去除有较好的促进作用。脱硫石膏作为常用的土壤调理剂，可以调节土壤pH值并改善土壤的持水性^[22-23]。因此本文选取上述3种物质作为生物刺激剂，比较施入有机肥、KNO₃、脱硫石膏对不同污染时长土壤的修复效果，同时对土壤微生态变化情况进行研究，结果可为明确土壤受到污染后的最佳修复时期及影响因素提供一定的理论基础和参考依据。

1 材料与方法 1.1 石油污染土壤

在陕北子长某油井附近取受石油污染5 a以上的表层黄绵土（0~20 cm），并在附近取洁净的未受污染土壤（土壤中石油烃背景值低于500 mg·kg^-1），密封储存于聚乙烯袋中带回实验室。两种土样分别经风干、除杂、破碎、过2 mm筛混匀后备用。石油污染黄绵土的土壤质地和主要理化性质如表 1所示。

新污染土壤的制备：向6.5 kg洁净土壤中加入130 g原油，原油取自陕北子长油田区，原油中总烃含量为81.24%，沥青和胶质含量低于1%，其他非烃化合物含量约为17.76%，石油烃组分的测定方法为柱层析法^[24]和气相色谱法^[25]（对16种多环芳烃进行测定）。将土壤与原油利用灭菌铲搅拌混匀，自然条件下放置7 d后进行修复处理，土壤中总石油烃、烷烃和多环芳烃的含量分别为16 847、13 067 mg·kg^-1和2 000 mg·kg^-1。

陈旧性污染土壤：称取6.5 kg从陕北子长采集的陈旧性污染土壤，土壤中总石油烃、烷烃和多环芳烃的含量分别为17 746、12 667 mg·kg^-1和3 567 mg·kg^-1。

1.2 修复方案

分别利用有机肥（取自西北农林科技大学，以干质量比1:2的猪粪: 稻壳并加入5.0% 的木炭渣经堆制腐解而成，基本性质^[26]见表 2）、KNO₃、脱硫石膏（GYP，取自西安热电阳光热力有限公司，理化性质见表 3）作为生物刺激剂对新污染和陈旧性污染土壤进行连续150 d修复，具体修复方案如表 4所示。每个处理3个平行。定期向土壤中加入灭菌纯水以保持土壤含水率为15%，每3 d翻动一次进行通氧。

分别于修复的第15、30、45、60、90、120、150 d取样，对土壤中的石油烃含量、pH值、微生物数量及微生物活性进行测定。

1.3 分析测定方法 1.3.1 石油烃的提取和测定

利用超声波萃取土壤中的总石油烃并用质量法进行测定。称取5 g待测土样置于通风橱风干研磨后，准确称取3.0 g干土壤于50 mL离心管内，加入10 mL正己烷和二氯甲烷的等体积混合液，冰浴条件下利用超声波破碎仪（JY96-ⅡN，宁波新芝生物科技股份有限公司）超声萃取10 min，功率为180 W。在-4 ℃条件下，以8 000 r·min^-1的速度离心15 min，过滤，收集滤液于称质量后的30 mL称量瓶内，重复上述操作两次，每次加入10 mL提取剂，合并滤液，将称量瓶置于通风橱内风干至恒质量^[27]。

1.3.2 土壤微生物数量的测定

采用稀释平板法^[28]对土壤中的微生物数量进行测定，主要测定步骤如下：

土壤中微生物的提取：配制足够量的无机盐液体培养基（Na₂HPO₄·H₂O 17.689 g，KH₂PO₄ 3.0 g，NH₄Cl 1.0g，NaCl 0.5 g，MgSO₄ 1 mL 1 mol·L^-1，微量元素2.5 mL，纯水1 000 mL）于锥形瓶中，将锥形瓶用封口膜封住，放入高压蒸汽灭菌锅，在121 ℃、103.4 kPa条件下灭菌30 min。待培养基冷却至室温后，准确称取1.0g土壤放入离心管内，加入9.0 mL灭菌的无机盐培养基，涡旋振荡1 min后，静置20 min，滗析获得上清液即为土壤中的微生物悬液。

土壤中微生物数量的测定：配制适量的LB固体培养基（NaCl 10 g，酵母浸膏5 g，蛋白胨10 g，纯水1000 mL，固体培养基加18 g琼脂，pH值为7.0）于锥形瓶中，按上述方法灭菌30 min。灭菌完成后，在无菌条件下将冷却至60 ℃左右的LB培养基倒入培养皿中，冷却待用。

将上述滗析获得土壤微生物悬液在10 mL离心管中进行梯度稀释（稀释至10^-4~10^-7），吸取100 µL的稀释液于培养皿中，在酒精灯附近用涂布棒进行涂布。将涂布好的培养皿倒置在30 ℃的电热恒温培养箱中48 h后，选取菌落数在30~300之间的平板进行计数。

1.3.3 降解菌活性测定

利用原油、3种多环芳烃混合物（菲1 g、蒽0.1 g、芘0.1 g，用二氯甲烷溶解并定容至100 mL）作为两种自定义碳源。利用Biolog-MT2板对石油烃降解菌活性进行测定，具体步骤为：准确称取各取样周期的干土壤样品1.0 g放入含有99.0 mL灭菌蒸馏水的锥形瓶内，振荡20 min并静置30 min后，分别移取150 µL上清液接种到MT2微孔板中，分别在每个微孔中加入5 µL原油和多环芳烃作为自定义碳源，以不添加任何碳源的A1~H4微孔为对照。将接种好的MT2板放入恒温培养箱（25 ℃）中培养168 h，每24 h记录一次数据，并记录微孔的平均颜色变化率（Average well color development，AWCD），AWCD计算公式如下：

(1)

式中：C_i为第i个反应孔的光度值，R_j为第j个对照孔的光度值。

1.3.4 土壤pH值的测定

向50 mL离心管中加入10 g待测土样及25 mL无二氧化碳蒸馏水，磁力搅拌1 min后，静置30 min，澄清后利用校准过的pH计（PHS-3CT，上海雷磁）进行测定。

1.4 降解动力学研究

利用零级、一级、伪一级、二级动力学方程对石油烃降解随时间变化情况进行拟合，相关系数最大者为反应的降解动力学模型。降解动力学方程如下：

零级降解动力学方程：

(2)

一级降解动力学方程：

(3)

二级降解动力学方程：

(4)

式中：c_t为随时间变化的污染物浓度，mg·kg^-1；c₀为污染物初始浓度，mg·kg^-1；k为零级降解动力学速率常数；t为降解时间，d；k₁为一级降解速率常数，d^-1；k₂为二级降解速率常数，d^-1。

对于石油烃降解率随时间的变化可参考伪一级动力学方程：

(5)

式中：y为石油烃降解率，%；a为由非线性回归曲线求得的常数；t为修复时间，d；k′为反应速率常数，d^-1。

1.5 数据统计分析

利用SPSS 18.0软件对石油烃降解率、pH值、微生物数量及硝氮、氨氮的测定结果进行相关性分析^[29-30]。

2 结果与分析 2.1 土壤中石油烃的去除效果

新污染土壤（污染7 d）和陈旧性污染土壤（污染5 a以上）中石油烃的去除效果如图 1所示。

新污染土壤中石油烃初始含量为16 847 mg·kg^-1。经150 d的修复处理，CK、Y、Y+N、GYP处理中的石油烃含量分别变为12 646、6 716、7 398、10 882 mg·kg^-1，石油烃降解率分别为24.94%、60.13%、56.09%、35.40%。加入有机肥和有机肥与硝酸钾混合物对新污染土壤中石油烃的去除效果较好（图 1a）。

加入生物刺激剂对陈旧性污染土壤中石油烃的去除效果如图 1b所示。经过150 d的修复，Y、GYP、Y+N处理中石油烃含量由17 746 mg·kg^-1分别降低至11 248、11 249、12 797 mg·kg^-1，石油烃去除率分别为36.62%、36.61%、27.88%。对于陈旧性污染土壤，加入有机肥或脱硫石膏对土壤中石油烃的去除效果较好。

2.2 石油烃生物降解的动力学特征

分别利用零级、一级、伪一级、二级动力学方程对石油烃降解随时间变化的趋势进行拟合，拟合参数见表 5和表 6。

根据表 5和表 6可知，新污染和陈旧性污染土壤中石油烃的生物降解均符合伪一级动力学方程。利用伪一级动力学方程对石油烃降解率随时间变化趋势进行拟合，得到图 2。根据图 2可知，不同修复处理的土壤中石油烃生物降解随时间变化均符合伪一级动力学方程，相关系数R²在0.9以上。

2.3 生物刺激修复对土壤微生态环境的影响 2.3.1 土壤pH值

图 3为修复过程中土壤pH值的变化曲线。相比CK土壤，经生物刺激修复处理的土壤pH值明显降低，土壤pH值由8.50~8.56降低至7.35~7.91。pH值接近中性时土壤微生物活性最大，pH值过高或过低都会抑制微生物的生长。本研究中的污染土壤为碱性土，加入生物刺激剂降低了土壤的pH值，为土著微生物的生长和代谢活性提供了有利条件。

2.3.2 土壤微生物数量

土壤微生物数量变化见图 4。对新污染土壤修复150 d，CK、Y、Y+N和GYP 4种处理中的微生物数量分别为4.7×10⁴、8.1×10⁶、6.9×10⁶、5.2×10⁵ cfu·g^-1土（图 4a）。经CK、Y、Y+N和GYP处理的陈旧性污染土壤中微生物数量分别为5.3×10⁴、8.6×10⁶、1.3×10⁷、4.0×10⁵ cfu·g^-1土（图 4b）。Y和Y+N修复的土壤中微生物数量最多，比CK和GYP处理的土壤中高出约2个数量级。因此，向不同污染时长土壤中加入有机肥可促进土壤微生物的增殖，且陈旧性污染土壤中微生物数量略多于新污染土壤。

2.3.3 降解菌的代谢活性

以石油烃和多环芳烃为自定义碳源，利用Biolog法测定了新污染土壤和陈旧性污染土壤中石油烃和多环芳烃降解菌的代谢活性，测定结果如图 5所示。

以石油烃为唯一碳源时，新污染和陈旧性污染土壤的AWCD值范围分别为0.08~0.51和0.06~0.49。不同污染时长土壤中微生物对石油烃的代谢活性相差较小。新污染土壤分别在CK和Y修复30 d和45 d时，土壤微生物对石油烃的代谢活性最大，此后逐渐降低。陈旧性污染土壤均在Y和Y+N修复15 d时，土壤微生物的代谢活性最大，此后活性随培养时间的增加而逐渐降低。

以多环芳烃为唯一碳源时，新污染和陈旧性污染土壤的AWCD值分别为0.01~0.11和0.01~0.27。陈旧性污染土壤中微生物对多环芳烃的代谢活性总体大于新污染土壤。经过120 d的修复，新污染土壤中Y处理对多环芳烃的代谢活性最大，CK和Y+N处理次之，GYP处理中微生物对多环芳烃的代谢活性最低；陈旧性污染土壤中微生物对多环芳烃的代谢活性由高到低顺序为Y>Y+N>CK>GYP，与新污染土壤趋势基本一致。结果表明，加入脱硫石膏修复处理的土壤中微生物对多环芳烃的代谢活性最差。

2.4 石油烃降解与硝氮、氨氮、pH值及微生物数量的相关性分析

对石油烃降解率、pH值、微生物数量及硝氮、氨氮进行相关性分析所得的结果如表 7所示。

由表 7可知，对污染时长不同的土壤，影响石油烃降解的关键因素不同。新污染土壤中的石油烃降解率与硝氮、pH值、微生物数量呈极显著相关，相关系数分别为0.686、-0.789、0.849（P＜0.01），与氨氮的相关性不显著。陈旧性污染土壤中石油烃降解率与土壤pH值呈极显著相关，相关系数为- 0.683（P＜0.01），与微生物数量及氮素含量无显著相关关系。

3 讨论

向污染土壤中施入有机肥进行修复处理是一种环保经济的修复方法。有研究表明，向Cd和Pb污染的稻田土壤施用生物有机肥可以提高土壤pH值以及土壤养分含量，并显著降低土壤有效态Cd和Pb的含量^[31]。Wellman等^[32]的研究发现，对于石油烃浓度为5 000 mg·kg^-1的污染土壤，施加有机肥修复41 d后，石油烃去除率高出对照组49%。本研究中，相比脱硫石膏，施入有机肥对不同污染时长土壤中的石油烃均有较好的去除效果。

有机肥中含有较高的有机质和丰富的养分，向污染土壤中施入有机肥，可为土壤土著微生物提供丰富的养分。此外，有机肥的保水、保温和透气性能可为微生物的生长增殖提供有利的环境条件。本研究中，向不同污染时长的土壤中施入有机肥进行修复处理，显著提高了土壤中微生物数量和代谢活性，进而提高了土壤中石油烃的去除效率。

生物刺激修复对新污染土壤中石油烃的去除效率高于陈旧性污染土壤，不同污染时长土壤中影响石油烃降解的关键因素存在差异。影响新污染土壤中石油烃降解效率的主要因素包括土壤硝氮含量和微生物数量。可能是由于在新污染土壤中，进入土壤中的石油烃使土壤微生物群落结构发生变化，土壤土著菌群处于“扰动期”，此时向土壤中补充养分或者增加土壤微生物数量均可提高降解菌对石油烃的代谢活性。

陈旧性污染土壤中石油烃降解与微生物数量及氮素含量无显著相关关系。一些研究认为^[33-35]，影响陈旧性污染土壤中石油烃降解的主要因素是土壤有机质对石油烃的吸附锁定。陈旧性污染土壤中的石油烃经过长时间的迁移转化，会缓慢进入有机质中的玻璃态刚性区域，污染物一旦进入介质孔隙内部，很难被微生物接触利用，一部分污染物形成结合残留态而直接被锁定，几乎不能被降解。

4 结论

（1）向石油污染黄绵土中加入有机肥可提高土壤微生物数量和活性，进而促进土壤中石油烃的去除。加入有机肥修复150 d，对新污染与陈旧性污染土壤中的总石油烃去除率分别为60.13%和36.62%。不同污染时长的土壤中石油烃的生物降解均符合伪一级动力学。

（2）新污染土壤中石油烃的去除效率与降解菌数量呈显著正相关关系，影响新污染土壤中石油烃降解的关键因素为土壤中降解菌数量和硝氮含量。陈旧性污染土壤中的石油烃降解率与微生物数量及氮含量无显著相关关系。生物刺激修复处理使不同污染时长的土壤pH值降低，为微生物的生长和活性提高提供了有利的环境条件。