2021, Vol. 40
2. 江南大学环境与土木工程学院环境过程与污染控制研究所, 江苏 无锡 214122;
3. 农业农村部农业生态与资源保护总站, 北京 100125
2. Institute of Environmental Processes and Pollution Control, School of Environmental and Civil Engineering, Jiangnan University, Wuxi 214122, China;
3. Rural Energy & Environment Agency, Ministry of Agriculture and Rural Affairs, Beijing 100125, China
农业生产及农村生活产排的铵态氮（NH4+-N）废水进入河道、湖泊，引起水体富营养化，劣化水质，威胁水体生态安全，是我国地表水水质主要超标项之一。去除水体NH4+-N的方法包括物理法、化学法和生物法等，其中生物法因便捷高效被广泛应用，但该方法存在菌体易流失[1]、不能重复利用及稳定性低[2]等缺陷。固定化微生物法是将菌体固定在载体上，因可稳定菌群结构、可重复利用、且利于固液分离，而逐渐成为一种受青睐的新兴处理方法。有研究发现利用聚壳糖凝胶球固定厌氧铁氨氧化细菌去除废水中的NH4+-N效率较高[3]，利用聚乙烯醇包埋法制作的固定化微生物对污染河水中NH4+-N去除率高达78.3%[4]。
目前用于固定微生物的方法包括吸附法、包埋法、共价法和交联法[5]，其中共价法与交联法反应相似，是靠化学结合的方法使细胞固定化，其反应激烈、操作复杂、条件不易控制，所以应用较少。吸附法是将生物炭和细菌菌液混合，利用生物炭的吸附作用以及微生物挂膜使细菌定殖在生物炭上[6]；包埋法是将生物炭和细菌菌液简单混合，利用化学溶剂作为包埋材料将混合后的生物炭与菌体固定在包埋材料内部形成固定化小球[7-8]。与共价法和交联法相比，吸附法和包埋法技术成熟、操作简便且对微生物影响小，故应用广泛[9-10]。常用的固定载体材料包括生物炭[11]、浮石、黏土矿物及高分子材料等[12-15]。其中，生物炭是高温厌氧热解产生的一类富碳物质，其孔隙丰富、比表面积大、稳定性强，能为微生物提供碳、氮源及栖息场所[16]，是一类较有前景的载体材料。前期研究发现，利用芦苇生物炭吸附固定活性污泥处理污水中的NH4+-N时，生物炭能够较好地固定优势菌群，72 h时NH4+-N去除率达到96.3%[17]。利用稻壳生物炭固定硝化菌剂对水体NH4+-N去除率可达85%，远超过单一稻壳生物炭30%的最大吸附效率[18]；以秸秆生物炭为载体固定黄假单胞菌处理湿地低温污水，NH4+-N去除率达到95%[19]。因此，生物炭固定具有脱氮功能的菌体，可提升其对水体NH4+-N的去除效果。
近年研究显示，花生壳生物炭平均孔径较大且为多孔隙结构，其组成与结构利于速效养分和细菌等微生物吸附固定[20-21]。此外，我国是世界上花生生产和出口量最大的国家，将占总产量三分之一的花生壳等废弃原料进行炭化处理，具有显著的开发利用价值和重要的生态意义[22]。但不同菌种表面结构、存活条件不同，花生壳生物炭固定新型脱氮菌对水体NH4+-N的吸附性能及效果仍有待进一步探索。本研究以花生壳生物炭为载体，比较吸附法和包埋法分别固定pd01脱氮副球菌（Paracoccus denitrificans）、假单胞菌d4-1（Pseudomonas）和拉乌尔菌（Raoultella）的微生物颗粒对模拟废水中NH4+-N的去除效果，以期探索高效的NH4+-N废水净化方法，同时为炭基载体材料的开发应用提供理论基础。
1 材料与方法 1.1 生物炭的制备将花生壳用清水洗净表面尘土、烘干，粉碎并过2mm筛，然后放入马弗炉内，通入N2，以5 ℃·min-1的速率升温至600 ℃热解2 h，冷却后取出。加入去离子水，用磁力搅拌器搅拌30 min，静置30 min，用抽吸泵滤出生物炭，并加入1 mol·L-1盐酸浸泡1 h，去除生物炭中灰分[23]。再用去离子水将生物炭洗至中性，烘干后储存于密封玻璃瓶内备用。生物炭组分和基本理化性质见表 1。
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表 1 生物炭组分和基本理化性质 Table 1 Biochar components and basic physicochemical properties |
所用菌种均由中国科学院上海高等研究院筛选并提供，3株细菌均为异养硝化-好氧反硝化菌，分别是pd01脱氮副球菌（Paracoccus denitrificans，T）、假单胞菌d4-1（Pseudomonas，J）和拉乌尔菌（Raoultella，L），扫描形态见图 1。
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图 1 供试菌株形态扫描电镜图（×10 000倍） Figure 1 Scanning electron microscopy(SEM)of T, J and L bacteria morphology(×10 000 times) |
供试菌株生长培养基：葡萄糖5 g·L-1、蛋白胨12 g·L-1、酵母提取物24 g·L-1、无水KH2PO4 2.31 g·L-1、K2HPO4·12H2O 16.43 g·L-1，调节pH为7.0~7.3，115 ℃灭菌20 min。固体培养基再加入20 g·L-1琼脂。
1.3 生物炭固定菌株的制备从-70 ℃环境取出甘油保存的菌种，融化后取100 mL菌液，稀释107倍后涂布于固体生长培养基中，放入30 ℃恒温培养箱培养24 h。待细菌长出后，挑取单菌落于液体培养基，在30 ℃、200 r·min-1的摇床内培养至OD600=1.0±0.2，将菌液离心得到菌体，用无菌水将菌体洗涤3次，最后加入原体积浓度为0.85% 的生理盐水重悬，4 ℃保存备用。为保证细菌活性，试验在48 h内完成。
吸附固定：按10 mL菌液加入1 g生物炭的比例将花生壳生物炭和菌液混合，然后在25 ℃、200 r·min-1摇床吸附18 h，并于4 ℃环境下保存，制得吸附菌株生物炭。
包埋固定：包埋剂材料为10%聚乙烯醇（PVA）和2%海藻酸钠（SA）的混合溶剂，其中PVA为主要包埋材料，SA为添加剂，二者混合的体积比为7:3[24]，交联剂为2%的饱和硼酸-CaCl2溶液，用Na2CO3调节pH至6.7。按生物炭与菌液1:10的比例取相应量的菌液，离心后加入约原菌液体积1/3的0.85%生理盐水将菌体重悬并与生物炭混合。混合后的生物炭-菌液置于摇床中200 r·min-1，30 ℃吸附2 h后再加入约原菌液2/3体积的SA-PVA混合物与其充分混匀，用3#注射器将混合后的物质逐滴滴入饱和硼酸-CaCl2中，在4℃环境下交联18 h，过滤并用无菌水洗涤3次，制得包埋细菌生物炭小球[25-26]。
1.4 NH4+-N去除性能试验模拟NH4+-N废水：在去离子水中按比例依次加入（NH4）2SO4 2.36 g·L-1、琥珀酸钠28.55 g·L-1、MgSO4·7H2O 1 g·L-1，NaCl 0.12 g·L-1、KH2PO4 0.5 g·L-1、K2HPO4 0.5 g·L-1、FeSO4·7H2O 0.03 g·L-1，pH调节至7.0~7.3，115 ℃灭菌20 min备用。NH4+-N浓度为500 mg·L-1。
分别取生物炭（BC）、吸附菌株生物炭（XF-BCT/J/L）、包埋菌株生物炭（BM-BC-T/J/L）加入到体积为100 mL的NH4+-N模拟废水中，同时设不加任何物质（Blank）、单加菌株（T/J/L）、单加包埋材料（BM）、加生物炭与包埋材料复合体（BM-BC）为对照，为尽量保证加入模拟废水中物质的量相同，处理中生物炭、细菌、包埋剂的量均保持一致。将所有处理置于30 ℃恒温培养箱中培养，每日摇晃1次。分别于1、3、7、15、30 d取培养后的模拟废水离心测定溶液中NH4+-N浓度，并利用下列公式计算NH4+-N去除率：
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式中：q为NH4+-N去除率，%；C0为相应天数Blank组中NH4+-N的浓度，mg·L-1；C1为处理后废水中NH4+-N的浓度，mg·L-1。
1.5 测定与分析方法培养后的模拟废水中NH4+-N含量用流动分析仪（Bram+Luebbe Crop，German）测定；扫描电镜（SEM）结构分析采用S4800型扫描电镜（HIECH，Japan）；傅里叶红外光谱（FTIR）分析采用Nicolette IS50 FT-IR（Thermo Fisher，America）测定；生物炭比表面积和孔隙分布采用Autosorb-iQ（Anton-Paar，Austria）全自动比表面积和孔径分布分析仪测定。数据处理使用Excel 2016和SPSS 20.0，方差分析数据显著性多重比较采用Duncan法；作图采用Origin 2019。
2 结果与分析 2.1 微生物固定化生物炭的表面结构特征由扫描电镜图（图 2）可以看出，BC呈蜂窝状孔隙结构，表面除零星分布一些细碎颗粒外，较为干净平整；而BM-BC表面孔隙结构被覆盖，表面呈褶皱状。从电镜图可以明显看到T、J和L菌分别以饼状、杆状与粒状形态分布于生物炭表面，这说明通过吸附和包埋两种方法，均能将3种菌株加载到生物炭表面，但不同方法细菌附着位置有所不同。吸附法固定脱氮副球菌、假单胞菌和拉乌尔菌（XF-BC-T、XF-BC-J、XF-BC-L）时，细菌主要附着在生物炭孔隙、沟壑、粗糙结构处。包埋法固定3种菌株时，细菌被包埋剂包裹与生物炭合为一体，其中BM-BC-L最为明显。此外，在包埋过程中，生物炭的孔隙结构会被包埋剂等填充、遮盖，中孔和大孔结构因此减少。
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图 2 生物炭、微生物固定化生物炭的扫描电镜图（×1 000，×10 000倍） Figure 2 Scanning electron microscopy(SEM)of biochar and immobilized microbial biochar(×1 000, ×10 000 times) |
两种微生物固定方法均显著影响生物炭的比表面积及孔隙结构（表 2）。与BC相比，XF-BC-T使生物炭微孔容积（VHK）、介孔容积（VDFT）和大孔容积（VBJH）分别缩小13.5%、19.5% 和25.8%，比表面积缩小17.2%。而XF-BC-J主要降低VHK和VBJH，VHK和VBJH分别减小5.4% 和9.4%，VDFT缩小1.2%，比表面积缩小5.5%。XF-BC-L处理比表面积增至269.54 m2·g-1，增幅达45%，VHK增加43%，但是VDFT和VBJH分别缩小36.6%和22.6%。
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表 2 固定菌株生物炭比表面积和孔隙结构特征参数 Table 2 Specific surface area (SSA)and pore structure parameters of biochar under different treatments |
包埋法固定3种微生物均缩小了生物炭的比表面积，减小VHK、VDFT、VBJH（表 2）。与BC相比，BMBC-T、BM-BC-J、BM-BC-L的比表面积分别缩小87.3%、91.4% 和96.3%；VDFT分别缩小84.1%、90.9%、98.2%，VBJH缩小70.1%、88.3%、89.1%。包埋处理下，生物炭微孔几乎被全部封堵。
2.3 微生物固定化生物炭的远红外光谱特征（FT-IR）吸附和包埋法固定3种微生物生物炭的红外光谱如图 3所示。BC的特征峰主要包括3 406.40、2 923.20、1586.79、1 094.27 cm-1，分别为羟基（—OH）、亚甲基（—CH2—）、羰基（C=O）、醚键（—C—O—C—）的伸缩振动峰。
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图 3 生物炭及微生物固定化生物炭的红外图谱特征 Figure 3 Infrared spectra of biochar biochar and fixed microbial biochar |
BM-BC-T、BM-BC-J、BM-BC-L在3 228.05、2923.20、1 586.79、753.97 cm-1处的特征峰均有所加强，并呈现不同程度的偏移（图 3b），并于2 260、1 714、1427、1 138、663 cm-1附近出现新峰，分别表征B—H伸缩振动、芳香酸酯C=O伸缩振动、双键或羰基相连的—CH2、C—O伸缩振动峰以及C—H面外弯曲振动。而XF-BC-T、XF-BC-J、XF-BC-L与BC相比，特征峰未发生显著变化，说明仅微生物附着不会影响生物炭表面官能团的结构和组成。
2.4 微生物固定化生物炭对水体NH4+-N去除的作用随处理时间推进，吸附固定微生物的生物炭对水体NH4+-N的去除率逐渐增加，30 d累计去除率达到97.9%~99.1%，基本完成水体NH4+-N去除（图 4a）。吸附的微生物经1~3 d活化，其负载生物炭对水体NH4+-N去除速率显著提高，15 d时，XF-BC-T、XFBC - J、XF - BC - L对水体NH4+-N去除率分别达到89.7%、90.1% 和72.0%，说明吸附脱氮副球菌和假单胞菌的生物炭响应速率快于吸附拉乌尔菌的生物炭。
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图 4 微生物固定化生物炭处理对水体铵态氮（NH4+-N）含量的影响 Figure 4 The variation of ammonia nitrogen(NH4+-N)contents under fixed microbial biochar treatments |
受亲水性包埋材料影响，包埋法固定微生物生物炭对水体NH4+-N的去除率呈初期最高，3~7 d小幅下降，7~30 d再次快速提高的过程（图 4b）。处理7 d时包埋法处理的NH4+-N去除率显著低于吸附法处理。至处理15 d时，BM-BC-T、BM-BC-J、BM-BC-L处理的NH4+-N去除率分别达到74.1%、74.2%、68.5%，平均较BM-BC高13~19个百分点，而不同包埋微生物处理间无显著差异。
表 3进一步显示，包埋法固定3种菌剂生物炭对水体NH4+-N的去除率在初期最高，其中BM-BC-J对水体NH4+-N的去除率仅1 d即达到24.6%，显著高于单加生物炭和单加菌剂处理。但随后吸附法固定微生物生物炭对水体NH4+-N的去除能力强于包埋法。处理7 d时，XF-BC-T、XF-BC-J和XF-BC-L对水体NH4+-N去除率较相应包埋固定3种微生物生物炭分别高1.16、2.15、3.44倍。此外，虽然吸附和包埋固定微生物生物炭对水体NH4+-N去除率在第30 d达到96% 以上，但微生物作用周期长、包埋剂阻塞孔隙等作用对水体NH4+-N去除的影响，仍需进一步探索。
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表 3 不同处理对铵态氮（NH4+-N）的去除率（%） Table 3 Removal rates of ammonium nitrogen(NH4+-N)under different treatments (%) |
生物炭对水体NH4+-N等离子的吸附性能，通过丰富的孔隙结构、较大的比表面积及表面官能团实现[27-29]。本研究利用花生壳生物炭为载体，吸附和包埋固定3种脱氮菌剂，对水体NH4+-N去除率为96.8%~99.1%，超过固定微生物的稻壳生物炭85%的最大吸附效率[18]。与固定微生物芦苇生物炭和秸秆生物炭的96.3%和95%相似。鉴于固定原理不同，吸附和包埋法固定微生物生物炭的表面结构特征差异显著。吸附法主要利用生物炭孔隙、表面官能团、静电作用力等实现微生物固定，对生物炭表面结构特征影响较小[30-31]，而包埋法则利用亲水包埋剂的“黏合”作用将微生物和生物炭组合为“一体”，加入饱和硼酸-CaCl2溶液，形成生物炭-包埋剂固态小球，对生物炭及细菌表面结构特征的影响较大。包埋剂封堵了生物炭的部分孔隙、填平沟槽，使生物炭表面变得较为平整（图 2），因此，包埋处理后的生物炭比表面积和微孔体积大幅降低，减少了生物炭对离子的吸附位点，导致3~7 d时利用包埋法处理的NH4+-N去除率显著低于利用吸附法的处理。
根据前期报道，加载菌体和包埋剂通过孔隙填充、表面驻留及遮掩等改变生物炭孔径和比表面积。本研究中，XF-BC-T和XF-BC-J均减小生物炭表面孔隙（微孔、介孔和大孔）和比表面积，这与Qi等[8]的研究一致，原因在于该类微生物更易附着于生物炭表面沟壑和孔隙结构处，从而减小孔隙体积和比表面积。与BC相比，XF-BC-L具有更大的微孔体积和比表面积，这可能是因为拉乌尔菌本身比表面积较大，更易分布于生物炭表面和较大孔隙结构中，在减小介孔和大孔孔隙度的同时，亦会因为菌体较大相互拥挤而产生微孔结构[7]。结合表 2发现，虽然XF-BC-L中生物炭微孔和比表面积增加，但NH4+-N的去除率并没有提高，说明由吸附拉乌尔菌引起的生物炭微孔和表面积的改变对水中NH4+-N去除效果没有显著影响。这与Taghizadeh等[31]的研究一致，去除水中NH4+-N时，生物炭的化学吸附比物理吸附效果更显著。
Li等[27]利用共聚物水凝胶去除废水中重金属离子的研究表明，凝胶多孔结构在离子吸附过程中主要通过官能团提供吸附位点。本研究利用亲水性包埋材料固定微生物，包埋固定法制备的生物炭除了含有大量的—OH、—CH2、羰基C=O等官能团外，还引入了C—H、—CH2、B—H、C—O和芳香酸酯C=O等新官能团，这主要由包埋材料带入，前期研究表明海藻酸钠、聚乙烯醇以及交联剂硼酸中均带有上述基团[32-33]。同时生物炭表面含有的—OH、—C=O等官能团，可通过形成氢键、氧化还原反应以及离子电荷等作用吸附溶液中的NH4+-N[34-35]，因此生物炭自身也表现出较高的去除能力。
此外，与BC不同，微生物负载生物炭对水体NH4+-N的去除效率还与本身微生物活性紧密相关。本研究吸附法固定微生物生物炭在投入水体初期（1~3 d），对水体NH4+-N的去除率较包埋法低，这是因为菌体被固定后，在初期（1~3 d）处于未激活状态。而包埋固定可以利用包埋材料进行吸附，但在快速达到吸附饱和后（0~1 d），对NH4+-N去除效果逐渐降低，这和Li等[36]和Loug等[37]的研究结果一致。3 d后细菌逐渐活化，利用吸附法固定的细菌与外部环境直接接触，优先利用水中NH4+-N作为N源，开始生长繁殖，去除能力快速升高[38-39]。因此3~7 d时吸附法固定微生物生物炭对水体NH4+-N的去除能力大幅度提升，到7 d高于包埋法2~3倍。包埋法则需要水中NH4+-N进行离子扩散到达小球内部才能被细菌利用，因此不利于菌株活化和生长，且包埋过程中选用海藻酸钠作为添加剂，虽然一定程度上改善了包埋小球的表面性能[38]，但海藻酸钠的包埋使细菌无法获取足够的营养，底物难以扩散[39-40]，因此进一步降低了3~7 d包埋固定微生物生物炭对NH4+-N的去除效率。7 d后，菌体从小球内部释放出来，并大量繁殖，吸收代谢水中的NH4+-N，去除效率快速升高[35]。
本研究制备的固定微生物生物炭可改变孔隙结构和比表面积，引入更多官能团，影响生物炭NH4+-N净化功能。但所用材料在实际应用中还存在周期长、成本较高等不足，后期也需要对其环境安全影响进行研究。
4 结论（1）吸附法和包埋法均能将pd01脱氮副球菌（T）、假单胞菌d4-1（J）和拉乌尔菌（L）固定在生物炭表面。
（2）吸附法固定T和J，使生物炭微孔、介孔容积减小，同时也缩小了比表面积；吸附固定L后，生物炭比表面积和微孔容积增大，但介孔和大孔容积减小。而包埋法固定微生物则使生物炭大孔、介孔以及比表面积都大幅降低，微孔几乎被全部封堵，同时引入C—H、—CH2和芳香酸酯C=O等新官能团。
（3）吸附法和包埋法制得的微生物生物炭均能有效去除水体NH4+-N，30 d NH4+-N去除率均在96.8%以上。相对包埋法，吸附法更利于负载微生物的生长，活化后微生物生物炭去除水体NH4+-N速率显著高于包埋法。
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