2016, Vol. 35文章信息
- 徐春英, 李玉中, 李巧珍, 毛丽丽, 林伟, 强晓晶, 郑欠
- XU Chun-ying, LI Yu-zhong, LI Qiao-zhen, MAO Li-li, LIN Wei, QIANG Xiao-jing, ZHENG Qian
- 土壤浸提液中硝酸盐氮氧同位素组成的反硝化细菌法测定
- Determination of 15N and 18O isotope abundance in the extractable soil nitrate by the denitrifier method
- 农业环境科学学报, 2016, 35(9): 1829-1836
- Journal of Agro-Environment Science, 2016, 35(9): 1829-1836
- http://dx.doi.org/10.11654/jaes.2016-0551
文章历史
- 收稿日期: 2016-04-19
我国农业生产中存在氮肥过量施用现象，这不仅造成氮肥利用率低，经济效益下降，而且长期过量施用氮肥会造成土壤氮素严重冗余[1-3]。土壤氮素形成的硝态氮极易通过淋溶作用进入水体，造成地表水富营养化、地下水的硝酸盐含量超标[4-8]及温室气体N2O 排放[9]等问题。硝态氮是土壤氮循环及迁移转化过程的中心形态，已有研究表明硝态氮中的氮、氧同位素组成是识别其来源和主要氮循环过程的有用工具[10-11]。
国内硝酸盐氮氧同位素组成的同时分析主要前处理方法为离子交换树脂法和反硝化细菌法。尽管离子交换树脂法是收集和富集NO3-的一个重要发展[12]，但是运用该方法分析硝酸盐氮氧同位素组成需要将样品富集、洗脱、中和过量的Cl-、冷冻干燥等，操作步骤繁琐，费时费力；另外，需要用到离子交换树脂、滤膜、Ag2O 等耗材和试剂，前处理的费用很高，这也成为该方法使用的一个限制因子[13]。反硝化细菌法是近几年硝酸盐氮氧同位素测试技术的重要进展，最早由美国普林斯顿大学的Sigman 等[14]提出用于海水和淡水的硝酸盐氮同位素自然丰度测定。该方法由自然存在的缺乏N2O 还原酶的反硝化细菌将水中NO3-转化为N2O，再由质谱仪测定N2O 气体的氮氧同位素组成，从而得到硝酸盐的氮氧同位素组成[14-15]。与离子交换树脂法相比，反硝化细菌法具有许多优点：（1）所需样品量低，该方法可同时分析浓度低至μg·L-1 的硝酸盐氮氧同位素组成，同时也由于降低了样品量而降低了样品的空白，测试结果准确；（2 ）可在常温常压下进行，不受有机氮及其他离子的影响；（3 ）样品预处理简单，并且氮氧同位素可同时分析，分析时间明显缩短，测试成本也极大降低。反硝化细菌法的诸多优点，已成为目前国际上先进的硝酸盐氮氧同位素组成测试技术[16-18]。
国外研究者已经应用反硝化细菌法对土壤浸提液的硝酸盐氮氧同位素进行测定[19-21]，并用于土壤硝酸盐溯源与氮转化过程研究[21]；相比而言，国内土壤中硝态氮氮氧同位素自然丰度运用较少，尤其是氧同位素应用更少，其主要原因是缺乏合适有效的分析方法。尽管国内已经报道了反硝化细菌法测定水体硝酸盐氮氧同位素方法[22-24]，但是用于土壤浸提液硝酸盐氮氧同位素分析的相关文献较少。本文在前期研究结果[23]的基础上进行了一些技术改进，使反硝化细菌法不但可以用于水体硝酸盐氮氧同位素的同时测定，而且适于土壤浸提液中硝酸盐氮氧同位素的同时测定。该方法的完善，有助于促进该方法在国内的推广和应用，从而加强土壤氮循环和迁移转化过程的研究。
1 材料与方法 1.1 仪器同位素比质谱仪Deltaplus（Thermo-Finnigan，美国），连接有PreCon 痕量气体预浓缩装置（Thermo，美国），CTC-Combi PAL 自动进样器（瑞士CTC Analyt原ics AG），高速离心机（HITACHI，himac CR21G，High-Speed Refrigerated Centrifuge，日本HITACHI公司），氮气吹扫仪（美国Organomation 公司），高压灭菌锅（日本SANYO 公司），流动注射分析仪（Lachant QC8000，美国Lachant 公司）。
1.2 试剂胰蛋白大豆琼脂培养基、胰蛋白胨大豆肉汤（美国BD 公司），试剂（NH4）2SO4、K3PO4、KCl、KNO3（分析纯，国药集团化学试剂有限公司），CaCl2（分析纯，西陇化工股份有限公司）、H3PO4（优级纯，国药集团化学试剂有限公司），磺胺（美国Sigma 公司），N-（1-萘基）乙二胺二盐酸盐（优级纯，国药集团化学试剂有限公司），国际同位素标准样品：USGS32、USGS34、US原GS35（购自美国USGS），IAEA-NO3（购自IAEA）。
1.3 溶液的配制TSB-A 培养液（含NO3-）：30 g胰蛋白胨大豆肉汤（TSB），1.0 g KNO3，0.5 g（NH4）2SO4，4.9 g K3PO4，1000mL去离子水，将460~480 mL 分装到500 mL培养瓶中，高压灭菌60 min 备用。
TSB-B培养液（无NO3-）：30gTSB，0.5g（NH4）2SO4，4.9g KH2PO4，2000 mL去离子水，分装到100 mL 的血清瓶中，高压灭菌60 min 备用。
1.4 实验方法 1.4.1 菌株的培养选用缺乏N2O 还原酶活性的反硝化细菌，即致金色假单胞菌P.aureofaciens（ATCC13985，Pseudomonasaureofaciens 购自美国农业部菌种保存中心），将该菌株接种并培养7 d待用。
1.4.2 土壤样品中NO3-的提取及测定称取10 g新鲜土壤样品，加入50 mL 2 mol·L-1的KCl溶液，振荡1 h，悬液静置3~5 min 后过滤。取15mL 滤液上流动注射分析仪（Lachant QC8000）测定土壤硝态氮浓度。
1.4.3 样品中NO3-转化为N2O将培养7 d的菌液在高速离心机5000~8000 r·min-1的转速下，18℃离心20 min，倒出上层清液，剩余菌体用无NO3-的TSB-B 培养液悬浮，并浓缩成2倍浓度的菌液，然后加入几滴止泡剂。吸取2~3 mL 浓缩菌液注入容积为20 mL 的钳口顶空瓶后，用高纯氮气（流速为30~40 mL·min-1）吹扫1~3 h，然后用气密性注射器将0.4~3.5 μg 的NO3-样品注入顶空瓶充分混匀，为避免瓶内压力过高，加样体积一般小于4mL，最后将顶空瓶倒置放入恒温箱中26℃过夜培养。次日注入0.15 mL浓度为10 mol·L-1的NaOH，裂解细菌并终止反应，同时吸收产生的CO2。
1.4.4 N2O氮氧同位素测定采用PreCon 痕量气体预浓缩装置、同位素比质谱仪（IRMS，Deltaplus）测定反硝化细菌反应产生的N2O 气体氮氧同位素，PreCon 配有CTC-Combi PAL自动进样器。载气为高纯氦气，流量为50~60mL·min-1，参考标准气体为校正过的99.9%N2O 气体。通过CTC-Combi PAL 自动进样器将顶空瓶中N2O 气体输送至PreCon，经PreCon 浓缩和捕集N2O 气体，最后由同位素比质谱仪同时测定氮氧同位素组成。
1.4.5 氮氧同位素测试结果的校正采用USGS32、USGS34 和USGS35 标准样品进行δ15Nnitrate和δ18Onitrate的校正：T=m×M+b
δ15Nnitrate 采用δ15NUSGS34=-1.8‰，δ15NUSGS32=+180‰（T，真实值）；
δ18Onitrate 采用δ18OUSGS34/VSMOW=-27.9‰，δ18OUSGS35/VSMOW=+57.5‰（T，真实值）；
氮同位素校正方程如下：
(1) 
(2) 氧同位素校正方程如下：
(3) 
(4) 根据以上标准样品的真实值（T）和测定值（M，meas），计算出m 和b，得到校正方程，根据测定值和校正方程计算出样品的真实值。
1.5 统计分析所得数据采用SPSS20.0统计软件进行显著性分析。
2 结果与讨论 2.1 实验过程优化 2.1.1 离心转速在初期的试验中[23]，采用30 000 r·min-1 的超高速离心，该步骤对于普通实验室较难操作，本实验中分别采用了3000、5000、8000 r·min-1 的转速离心20min 进行菌液浓缩，对比各自上清液的OD600 值发现，离心转速为3000 r·min-1时OD600 值要显著高于5000 r·min-1 和8000 r·min-1（表 1），而5000 r·min-1 和8000 r·min-1没有显著差异，这说明离心转速为5000r·min-1时已经基本将所有的菌体离心沉淀，并且浓缩后菌量也满足后续试验要求，因此，菌液浓缩采用5000~8000 r·min-1转速离心均可，这对于普通实验室较易实现。
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将浓缩菌液加入顶空样品瓶密闭后，不需采用价格昂贵的高纯氦气，而是采用相对较便宜的高纯氮气进行吹扫，设置流速为30~40 mL·min-1分别吹扫20min、40 min、1 h、2 h和3 h后再加入标样USGS34 进行氮氧同位素测定，比较发现1 h 以上吹扫时间下标样USGS34 的δ15Nnitrate 和δ18Onitrate 测定值没有显著差异（表 2），而与不吹扫、吹扫20 min 和40 min 下δ15Nnitrate 和δ18Onitrate 值差异较大，尤其δ15Nnitrate差异显著，说明吹扫1 h即可以将菌液中的N2O 去除并保证了顶空瓶的厌氧环境。另外，从表 2可以看出，菌液空白m/z 44（14N14N16O）的面积为2.29Vs，证明菌液中确实含有N2O 气体，加入USGS34 标样后，δ15Nnitrate 和δ18Onitrate也确实与吹扫后差异相当大，如果不吹扫或者吹扫时间不足，就会影响硝酸盐样品所产生的N2O气体氮氧同位素的准确测定。因此，本研究建议吹扫时间至少要保证1 h 以上。
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在初期的试验中[23]，TraceGas 标准配置是Gilson自动进样器和容量为12 mL的样品瓶，但是该样品瓶不能直接作为反硝化细菌和样品的反应瓶，需要抽取2mL 反硝化产生的N2O 气体注入到预抽真空的12mL 样品瓶中才能进行测定。本研究改用连接CTCCombiPAL 自动进样器，通过设置仪器自动进样器参数及改造样品盘，采用20 mL 的顶空钳口瓶进行反硝化反应，同时根据样品浓度加入0.4~3.5 μg NO3-，为避免瓶内产生过高的压力，加样体积应尽量小于4mL，这个加样量低于前期试验样品量[23]，更明显低于传统离线方式同位素测试所需6~20 μg NO3-的样品量[22]。这样采用20 mL的顶空钳口瓶可以反硝化反应后直接进样，无需将N2O 气体另外进行转移[22-23]，从而避免了因N2 O 气体转移而可能产生的同位素分馏及实验误差。
2.1.4 进样量为确定PreCon 分析系统结合同位素比质谱仪合适的进样量，本研究考察了不同进样量下标准样品USGS34 的硝酸盐氮氧同位素值（表 3）。从表 3 结果可以看出，在0.1~0.8 μg NO3--N 样品量之间，PreCon预浓缩分析系统结合同位素比质谱仪分析，测定结果没有显著性差异，均能得到较稳定、准确的测定值和校正值，比传统离线方式同位素测试所需1.4~4.5 μgNO3--N 的样品量要低很多[14]。本研究推荐一般用量为0.2~0.4 μg NO3--N。
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表 4 对不同制备时间获得的USGS34 的δ15N 和δ18O 实测值进行了比较。结果发现，δ15N 和δ18O 值非常稳定，从2014 年9 月12 日—2015 年3 月16 日测定的15N 值非常接近，位于-2.32‰~-2.39‰之间；而δ18O 测定值稳定性稍差一些，测定值位于-23.96‰~-24.23‰之间，测定值之间也没有显著差异，以上结果表明，在6 个月内反硝化细菌法同时测定硝酸盐的δ15N 和δ18O 是准确的、稳定的、可行的。同样从表 4 可以看出，同一制备时间的5 个平行样品之间δ15N 的SD 介于0.05‰~0.09‰之间，δ18O 的SD 介于0.28‰~0.48‰之间，均低于USGS34 给定的δ15N 和δ18O 的标准偏差（滓δ15N≤0.2‰，滓δ18O≤0.6‰），表明该方法的准确度、精密度、稳定性较好。
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但是需要指出的是，不同样品制备时间测定的氮氧同位素值仍然有差异，这可能主要与不同批次反应菌株的差异有关[15]。为减少此类误差，本研究建议尽量采用新活化或者转接代数较少的菌株进行反硝化反应。
2.3 浸提剂对土壤硝酸盐氮氧同位素值的影响目前国内较多采用2 mol·L-1 KCl 或者0.01 mol·L-1 CaCl2溶液来浸提土壤中的硝酸盐，已有研究发现该两种浸提剂对土壤中硝酸盐的测定结果并无显著差异[25]。由于不同生产厂商及不同批次的去离子水、KCl以及CaCl2可能质量不同，难以保证研究人员采用的浸提剂和标准溶液的配置采用的试剂质量完全一致，因此，本研究比较了有代表性的去离子水（H2O）、2 mol·L-1 KCl 及0.01 mol·L-1 CaCl2 作为样品加入反硝化菌液后产生的N2O的丰度和面积，以此来探究浸提剂是否影响土壤浸提液中硝酸盐氮氧同位素值的测定（表 5）。从表 5 可以看出，本研究所用的0.01 mol·L-1 CaCl2中可以检测出微量硝酸盐，而去离子水（H2O）和2 mol·L-1 KCl中未检出硝酸盐。PreCon结合同位素质谱仪进一步检测反应产生的N2O 发现，无论是吹扫后的空白反硝化细菌菌液、去离子水（H2O）还是2 mol·L-1 KCl 和0.01 mol·L-1 CaCl2 都能检测到一个N2O 峰，14N14N16O 的丰度空白最低，面积也是空白最小。在本实验室通常的0.15 mL的加样量下，各个处理之间丰度和面积没有显著差异，但是随加样量增加一倍（0.30 mL），0.01 mol·L-1 CaCl2 产生N2O的丰度和面积要显著高于其他处理，其他处理之间没有显著差异，这说明此次试验的浸提剂CaCl2自身含有的硝酸盐可能会影响样品的测定，而本实验用KCl和H2O中的硝酸盐对样品测定不会产生影响。
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本研究同时考察了去离子水和2 mol·L-1 KCl 分别配制的标准样品USGS32、USGS34、USGS35、IAEA原NO3 的反硝化细菌法测定的氮氧同位素值（表 6），从表 6可以看出，尽管各个标准样品氮氧同位素测定值存在差异，但是差异不显著（α=0.05）。这表明2 mol·L-1 KCl 浸提剂自身并不影响反硝化细菌的生长和浸提液中硝酸盐氮氧同位素组成的测定，这点与M覬rkved等[19]认为2 mol·L-1 KCl通过改变反硝化效率而影响测定值的结果不同，但Rock 等[20]通过测定2mol·L-1 KCl 浸提液中硝酸盐的氮氧同位素组成来进行土壤硝酸盐溯源，也并未指出浸提剂对反硝化效率的影响。
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尽管如此，空白试验数据表明，H2O、2 mol·L-1KCl 及0.01 mol·L-1 CaCl2 溶液的反硝化反应可能也都产生了微量N2O 气体（见表 5，m/z 44 面积），这说明H2O、KCl、CaCl2可能都含有微量的硝酸盐，这可能也是不同溶液的标准样品氮氧同位素测定值存在差异的原因。因此，为了减少系统和测定误差，一是建议购买纯度较高的浸提剂和去离子水，二是建议土壤硝酸盐浸提液统一采用去离子水配制的标准溶液来校正，且每一次测定都应采用标准样品重新做校正曲线。
2.4 保存条件对土壤中硝酸盐氮氧同位素值的影响以2 mol·L-1 的KCl 溶液为浸提剂，考查了保存条件对土壤中硝酸盐氮氧同位素测定值的影响。结果显示，土壤浸提液的保存方式显著影响了土壤浸提液中硝酸盐的氮氧同位素值（表 7）。由表 7 可见，-18℃冷冻保存效果较好，即使冷冻保存30 d，土壤浸提液硝酸盐的δ15N 和δ18O 实测值仍然与新鲜样品当日测定值相近，没有显著差异。在4℃冷藏条件下，各土层硝酸盐的δ15N 在冷藏30 d内均与新鲜样品当日测定值相近，没有显著差异；但是，各层次土壤硝酸盐的δ18O 在10 d之内没有显著变化，在20 d和30 d，除40~60 cm 土层外，其余均显著低于新鲜样品当日测定值，δ18O 最大降低了3.88‰，变化非常大，其比例范围为19.27%~213%。由此可见，土壤样品浸提后，为保证其δ15N 和δ18O 的准确性和稳定性，一方面应冷冻保存，另一方面应尽快测定。
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土壤微生物组成复杂，其浸提液可能含有土壤原生反硝化细菌及其N2O还原酶，从而干扰反硝化细菌还原NO3-产生N2O 的氮氧同位素测定。对此，M覬rkved等[19]建议将土壤浸提液80℃加热1 h，以消除土壤原生反硝化细菌对其硝酸盐氮同位素测定的干扰。为考察加热对同时测定硝酸盐氮氧同位素的影响，同时鉴于每个研究者的土壤浸提液含有的原生反硝化细菌不尽相同，本研究比较了将USGS34、IAEA-NO3 标准样品以及土壤样品加热与否的氮氧同位素测定值，结果发现，δ15N 测定值没有显著差异（表 8），表明加热与否对δ15N 测定值没有显著影响，这与M覬rkved 等[19]的结果是一致的；但是加热后标准样品的δ18O测定值要显著升高（表 8），这说明加热可能促使标样NO3-的O 与空气中O2的氧发生了交换，导致反硝化作用产生的N2O 气体产生了同位素分馏，而空气中的δ18O-O2为23.5‰，比USGS34（δ18O=-23.77‰）及IAEA-NO3（δ18O=21.33‰）中δ18O 的实测值都要高，所以加热过程可能导致标准样品的O 与空气中的O2 发生了交换，使其δ18O 测定值显著升高，也说明了加热影响了标准样品δ18O 的准确测定。与标准样品不同的是，土壤样品加热之后δ18O 测定值有的升高（表 8），有的降低，没有明显的规律性，这说明不加热时土壤原生反硝化细菌可能产生一定作用，但是加热又会产生同位素的热交换，所以加热前后δ18O 测定值没有显著差异，δ15N 测定值同样也没有显著差异。因此，为保证测定结果的准确性及节省测试时间，本研究建议对于土壤浸提液硝酸盐氮氧同位素的同时测定，浸提液可以直接和反硝化细菌反应，而无需加热，这也与Rock等[20]直接采用2 mol·L-1 KCl土壤浸提液进行反硝化反应测定其硝酸盐氮氧同位素组成的方法是一致的。
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按照优化后的方法测定了不同肥料处理田间土壤浸提液硝酸盐的氮氧同位素组成，结果见表 9。从表 9可以看出，单施尿素田土壤硝酸盐δ15N 为-3.26±0.74‰，农户施肥田（底肥为复合肥，追施尿素）土壤硝酸盐δ15N 为-3.45±1.04‰，二者非常接近，而δ18O明显不同，分别是-5.23±1.03‰，3.96±0.88‰。农户施氮肥多为尿素，而尿素分解产生并释放的NH4+进一步经过硝化作用产生硝酸盐，所以这两个处理的硝酸盐主要来源于肥料释放的NH4+，其δ15N 和δ18O 结果也是位于Fenech 等[18]修正的硝酸盐来源的阈值范围，该结果与实际情况相符；与施尿素田和农户施肥田明显不同的是，有机肥田土壤硝酸盐δ15N 为9.40±1.54‰，δ18O 为1.48±0.97‰，这也位于有机肥来源的δ15N 和δ18O 的阈值范围[18]，与农户施用有机肥的情况一致。
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本研究优化了已发表的反硝化细菌结合Trace原gas-同位素比质谱仪测定硝酸盐氮氧同位素的方法，并应用PreCon-同位素质谱仪测定。该方法具有较好的准确度、精密度和稳定性，且仅需很小的样品量，并且在普通实验室即可完成前处理过程，具有很好的推广应用前景。实验用去离子水及浸提试剂大多也含有微量的硝酸盐，随加样量增多，有可能会影响浸提液中氮氧同位素的测定，因此建议购买纯度较高的浸提剂和去离子水，二是建议土壤硝酸盐浸提液统一采用去离子水配制的标准溶液来校正，且每一次测定都应采用标准样品重新做校正曲线。冷冻保存效果较好，δ15N 和δ18O值基本没有变化，因此土壤样品浸提后，一方面应冷冻保存，另一方面应尽快测定。加热对硝酸盐氮同位素测定没有显著影响，但会引起氧同位素的分馏，因此建议土壤浸提液直接和反硝化细菌进行反应来测定硝酸盐氮氧同位素组成。需要指出的是，反硝化细菌可以将土壤中硝酸盐（NO3-）和亚硝酸盐（NO2-）同时还原为N2O 气体，故测定结果实际为二者混合物的平均氮同位素组成，因此当亚硝酸盐同时存在时，可以预先从样品中除去。其方法是，加足够量的抗坏血酸使溶液的pH 至3.5 左右，抗坏血酸不与硝酸盐作用，而仅与亚硝酸盐选择性反应，使其转换为NO并被惰性气体氦气连续移走。抗坏血酸对反硝化细菌无毒，不影响后续硝酸盐的分析。因本研究土壤样品中未检测到亚硝酸盐，故省去该步骤。综上所述，反硝化细菌法适用于土壤浸提液中硝酸盐氮氧同位素组成的同时测定。
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