2021, Vol. 40
2. 农业农村部环境保护科研监测所, 天津 300191;
3. 天津商业大学生物技术与食品科学学院, 天津 300134
2. Agro-Environmental Protection Institute, Ministry of Agriculture and Rural Affairs, Tianjin 300191, China;
3. College of Biotechnology and Food Science, Tianjin University of Commerce, Tianjin 300134, China
由于抗生素具有提高畜禽生长速度、预防和治疗畜禽疾病的作用，因此其在畜禽养殖场中的使用较为广泛，据专家统计，我国用于畜禽养殖业方面的抗生素占全国抗生素总使用量的52%[1]。但大量与长期使用抗生素会增加畜禽肠道中耐药菌的产生与累积，耐药菌与粪便共同进入环境，使畜禽粪便成为环境中抗生素抗性基因（Antibiotic resistance genes，ARGs）的重要来源[2]。此外，由于ARGs不仅在垂直转移方式上可亲代传递，其还具有水平转移的能力，可在养殖场周边的环境介质微生物中传播和扩散[3]，甚至会扩散到致使人类患病的细菌中，从而威胁到人类健康[4]。已有很多学者对不同畜禽养殖场及周边环境中ARGs的污染状况进行了研究，研究主要集中在畜禽养殖场粪便、污水以及粪肥还田后土壤中ARGs的污染丰度和种类方面。例如，闫书海[5]对浙江和杭州不同规模养殖场（猪、鸡和鸭）的粪便和污水中2类典型ARGs进行检测，发现四环素类的tetA、tetG、tetM、tetO、tetQ、tetW与磺胺类的sul1、sul2在所有样品中均有检出，且磺胺类ARGs的相对丰度普遍高于四环素类；彭晶等[6]在施粪肥后的土壤中检出了大环内酯类中的erm35、ermB、ermT、ermX、ermF和erm36，其中丰度最高和最低的分别为ermB和erm36；MCKINNEY等[7]在猪场和鸡场氧化塘沉积物中检测出磺胺类ARGs（sul1和sul2）和四环素类ARGs（tetO和tetW），且含量为猪场高于鸡场；YUAN等[8]在武汉畜禽养殖场的废水中检测到了四环素类tetA、磺胺类sul1以及喹诺酮类oqxB等常见的ARGs。
综上所述，目前国内外研究主要聚焦于ARGs的污染水平和种类等污染特征分析。然而，随着集约化养殖场的发展和在环保要求下，畜禽养殖场采用的不同粪污处理工艺，粪污中污染物的转归和降解日益受到重视，但是这些粪污处理工艺对ARGs的去除效果仍不太清楚，尤其是完全针对畜禽养殖场粪便和污水不同处理工艺中ARGs的赋存规律与去除效果的研究十分有限。因此，本文以天津市猪场、牛场、鸡场中典型粪污处理工艺为研究对象，研究目的：（1）分析不同畜禽养殖场新鲜粪污中ARGs的总体污染特征；（2）探讨不同养殖场污水处理工艺对ARGs的总体去除效果，以及不同处理单元中ARGs的赋存规律；（3）比较不同粪便处理工艺对ARGs的去除效果，以及关键环节中ARGs的赋存规律。从而为控制我国畜禽养殖场中ARGs污染与减少周边环境耐药性传播提供科学依据，为养殖场粪污中ARGs的消减提供基础数据。
1 材料与方法 1.1 养殖场的基本信息本次试验选取天津市具有较为常见、通用和完整的粪污处理工艺的3类畜禽养殖场为研究对象，其中牛场粪便的处理方式主要是堆肥和灭菌晾晒作垫料，两者基本原理均为好氧发酵，区别主要是灭菌作垫料处理是为了保护牛的健康增加灭菌流程；鸡场粪便的处理方式为堆肥；猪场使用异位发酵床对畜禽粪便进行处理，异位发酵床与堆肥基本原理均为好氧发酵，但异位发酵床中有芽孢杆菌、酵母菌和乳酸菌等多种菌株参与。牛场和猪场对污水的处理方式都主要以厌氧发酵为主。三家养殖场粪污处理工艺流程如图 1所示。
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图 1 三家养殖场粪污处理工艺流程 Figure 1 Manure treatment process flow of three farms |
牛场，猪场和鸡场的地理位置分别为39°14′29″ N、117°34′12″E，39°21′31″N、117°46′01″E和39°44′ 33″ N、117°14′ 18″ E；存栏量分别为2 000、1 500头和600 000只；粪便日排放量分别为4 000、30 000 kg·d-1和60 000 kg·d-1，牛场和猪场污水日排放量分别为20 000 L·d-1和72 000 L·d-1。
1.2 样品的采集、运输和保存试验样品采集于2019年7月上旬，采集的样品为畜禽新鲜粪污，以及各处理单元中粪污，具体采样点如图 1所示。采集液体样品时，均设置多点采集，然后混合均匀为1份样品，连续采样3 d，作为每个采样点的3个平行样品，共计27个样品（猪场12个和牛场15个）；固体样品为多点采集并混合为均一样品，不同采样点采集3个平行样品，共计45个样品（猪场9个、牛场15个和鸡场21个）。采集后的样品放到含有冰袋的白色泡沫箱中，低温储存，5 h内送到实验室-20 ℃的冰箱保存，等待处理。
1.3 样品的预处理固体样品放入冷冻干燥机中去除水分，并将得到的干样磨碎，混合，过2 mm的网筛，液体样品过5 µm滤膜以去除漂浮的杂质。在提取DNA前，将样品于-20 ℃冷冻储存。
1.4 基因组DNA的提取与PCR反应试验使用的Fast DNA SPIN Kit for soil试剂盒购买于美国MP Biomedicals生物医药公司，对样品DNA的提取严格遵守试剂盒的操作指南，提取出DNA的纯度采用超微量紫外可见分光光度计检测。以目标DNA模板进行PCR检测，PCR反应体系为25 µL，包括12.5 µL 2×EasyTaq PCR SuperMix（0.1 U·μL-1 Taq DNA Polymerase、2×PCR buffer、3 mmol·L-1 MgCl 2和0.4 mmol·L-1 dNTPs），前后端引物各0.5 µL（10 μmol·L-1），0.5 µL DNA模板和11 µL ddH2O。反应条件：95 ℃预变性5 min，95 ℃变性30 s，退火30 s后，72 ℃延伸30 s，共35个循环。基因引物的详细信息如表 1所示。反应结束后，采用DNA凝胶电泳检测，观察条带是否有目的基因存在。
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表 1 PCR引物的详细信息 Table 1 The detail information of PCR primer |
试验检测目标包含四环素类（tetX、tetW、tetQ、tetO和tetL）、磺胺类（sul1和sul2）、大环内酯类（ermB和ermC）、喹诺酮类（oqxB、qnrB和qnrS）、链霉素类（strA）抗性基因以及基因元件intI1，PCR引物的详细信息如表 1所示。qPCR的反应体系为20 µL：TB Green Premix Ex Taq 10.0 µL、前后端引物各0.4 µL、ROX Reference DyeⅡ0.4 µL、ddH2O 6.8 µL和DNA模板（已稀释10倍）2 µL（对照以ddH2O为模板），3个平行，用7500实时荧光定量PCR仪（Applied Biosystems美国）进行实时qPCR检测。qPCR扩增过程：95 ℃预变性30 s，95 ℃变性5 s，60 ℃退火34 s，40个循环。在60~95 ℃之间进行熔点曲线分析，根据标准曲线[9]计算出目标基因的拷贝数，随后计算出目的基因的相对丰度（ARGs拷贝数/16S rRNA基因拷贝数）。抗性基因去除率计算公式：
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式中：j表示特定的基因；C0j为基因j处理前的相对丰度；Ctj为基因j处理后的相对丰度。
1.6 数据分析相对丰度、平均值、标准差和lg值在Excel 2007中计算；使用R软件的Pheatmap制作热图；堆积柱状图使用Origin2017绘制；采样流程图使用Word绘制。
2 结果与讨论 2.1 不同畜禽养殖场原始粪污中ARGs的污染特征新鲜粪污中ARGs的丰度和种类如图 2所示，13种ARGs与intI1在被检测样品中全部检出，这表明目标ARGs在畜禽养殖场粪污中普遍存在。值得注意的是，在养殖场粪污的5类ARGs中，喹诺酮类ARGs的相对丰度最低，为10-7~10-5，四环素类和磺胺类ARGs的相对丰度普遍较高，分别为10-4~10-1和10-4~10-2，其原因可能是养殖场粪污中四环素和磺胺类抗生素残留水平较高。例如，阮蓉等[18]在检测天津市20家牛场、猪场和鸡场粪污中的抗生素残留情况后，发现3种畜禽养殖场中四环素类抗生素污染水平较高，这可能是导致四环素类ARGs污染水平较高的原因。对于不同畜禽粪便，3个畜种养殖场粪便中ARGs的污染特征有较大差异，鸡场和猪场粪便中大环内酯类ARGs的相对丰度（10-4~10-2）明显高于牛场（10-6~ 10-5）；鸡场和牛场中磺胺类ARGs的相对丰度（4.85× 10-4~1.36×10-3）低于猪场（1.36×10-3~3.63×10-3）。此外，鸡场和猪场粪便中目标四环素类ARGs的相对丰度普遍较高（10-4~10-1），这与邹威等[19]对华北地区鸡场和猪场粪便中ARGs的相对丰度比较后的结果相似，这可能与四环素类抗生素使用量大以及该类ARGs较高的水平扩散能力有关。猪场和牛场污水中ARGs的污染特征如图 2中PW和CW所示，除喹诺酮类外，其他类ARGs污染水平普遍较高，这说明养殖污水同样是ARGs的储存库。值得注意的是，猪场污水中四环素类、磺胺类和大环内酯类ARGs的相对丰度（10-3~10-2）明显高于牛场的（10-6~10-4），这与ZHANG等[20]对猪场和牛场污水中ARGs丰度的对比结果一致。
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JM：鸡场粪便；PM：猪场粪便；CM：牛场粪便；PW：猪场污水；CW：牛场污水 JM: chicken farm feces; PM: pig farm feces; CM: cattle farm feces; PW: pig farm sewage; CW: cattle farm sewage 图 2 鸡场、猪场和牛场原始粪污中ARGs的相对丰度 Figure 2 Relative abundance of ARGs in raw manure from chicken, pig and cattle farm |
猪场污水各处理单元中13种ARGs和基因元件intI1的相对丰度如图 3（A）所示，除在氧化塘中未检出qnrB外，其余ARGs均在所有处理单元中检出。5类目标ARGs中，喹诺酮类ARGs的相对丰度最低，为4.31×10-7~9.61×10-5，其余ARGs的相对丰度普遍较高，其中四环素类ARGs中tetO和tetL（10-3~10-2）普遍高于tetX和tetQ（10-4~10-3），大环内酯类ermB的相对丰度（10-3~10-2）普遍高于ermC（10-4~10-2）。
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图 3 不同污水处理单元中ARGs的相对丰度 Figure 3 The relative abundance of ARGs in sewage from different treatment units |
表 2为猪场污水中13种ARGs及基因元件intI1在各处理单元中的去除效果和总去除效果。首先分析猪场污水处理系统对ARGs的总体去除情况，其中tetX、tetW、tetQ、tetO、tetL、ermC、ermB和sul1总体呈现正去除效果，相对丰度（lg值）下降了0.06（tetO）~1.53（tetW），而sul2、qnrS、qnrB、oqxB和strA的相对丰度（lg值）上升了0.03（strA）~1.19（qnrB）。CHEN等[21]发现厌氧发酵处理对江苏省猪场污水中四环素类tetW、tetQ、tetO与大环内酯类ermC、ermB有良好的去除效果，同时未能有效去除喹诺酮类qnrS、oqxB与磺胺类sul1、sul2，与本试验的结果一致。intI1相对丰度（lg值）增加了0.09。此外，不同处理单元对ARGs的去除效果不同，ARGs去除效果最好的主要集中在厌氧发酵池和贮存池，其中贮存池为该处理工艺的最后一环，污水储存的时间较长，可继续进行厌氧或兼性厌氧等发酵反应，此外，污水中微生物群落的变化，同样可能对ARGs产生一定的降解作用。tetX、tetW、tetQ、tetO、sul1、ermC和ermB在厌氧发酵单元中降低较多，其中tetW的去除效果最好，相对丰度（lg值）下降了1.12；tetQ、sul2、qnrS、oqxB和ermC的相对丰度在贮存池单元中下降较多，其中sul2和oqxB的去除效果最好，相对丰度（lg值）均下降了0.59。
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表 2 猪场污水中ARGs在不同处理单元中的去除效果（lg值） Table 2 Removal effect of ARGs in pig farm sewage in different treatment units(lgs) |
如图 3（B）所示，在对牛场污水中13种ARGs及基因元件intI1检测后发现，除了oqxB和ermB外，其余目标ARGs在所有处理单元中均有检出，其中磺胺类ARGs相对丰度最高，为6.83×10-4~1.73×10-2；喹诺酮类ARGs相对丰度最低，为3.92×10-7~2.45×10-6，此外，四环素类ARGs中tetX、tetW、tetQ和tetO（10-4~ 10-3）的相对丰度高于tetL（10-5~10-3），大环内酯类ermB（10-4）的相对丰度高于ermC（10-6）。
表 3为牛场废水中13种ARGs及基因元件intI1在各处理单元中的去除效果和总去除效果，其中tetX、tetW、tetQ、tetO、tetL和ermC总体呈现正去除效果，相对丰度（lg值）降低了0.002（tetX）~2.09（tetL）；其余ARGs均表现出富集现象，其中相对丰度升高最多的为qnrS和qnrB，lg值均升高了0.76，这可能与这几种ARGs的宿主微生物在不同环境条件下具有较强的生存能力有关。此外，ARGs在调节池单元中的去除效果优于其他处理单元，tetX、tetW、tetQ、te⁃ tO、sul2、qnrB和strA在该处理单元中相对丰度均呈现下降趋势，其lg值下降了0.22（sul2）~0.63（tetQ）。分离池中ARGs去除效果最差，13种ARGs中有9种（除qnrB和qnrS外）出现富集现象，其中tetO的相对丰度增加最多（0.72），另外在该单元中，基因元件intI1虽有所去除，但相对丰度（lg值）仅下降了0.01。
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表 3 牛场污水中ARGs在不同处理单元中的去除效果（lg值） Table 3 Removal effect of ARGs in cattle farm sewage in different treatment units(lgs) |
综上所述，畜禽养殖污水处理各单元中ARGs普遍存在，猪场污水中ARGs的检出率为97%，牛场污水中的检出率为95%。猪场和牛场污水处理工艺对ARGs的去除效果有较大差异，猪场污水在厌氧发酵后，8种ARGs的相对丰度下降，lg值平均下降了0.81；牛场污水中6种ARGs的相对丰度下降，lg值平均下降了0.57，值得注意的是，猪场和牛场的污水处理工艺对5种四环素类ARGs均呈现正去除效果，下降最多的为tetL（2.09）；此外，猪场污水工艺对tetX、tetW、tetQ、sul1、ermC和ermB的去除效果优于牛场处理工艺，而对tetO和tetL去除能力，则是牛场优于猪场。
2.3 猪场、牛场和鸡场粪便处理工艺对ARGs的去除效果 2.3.1 猪场粪便处理工艺对ARGs的去除效果图 4（A）为猪场粪便处理工艺各单元中ARGs的污染情况及赋存规律。13种ARGs及基因元件intI1中，除了部分样品中喹诺酮类qnrS、qnrB和oqxB未检出外，其他目标ARGs均有检出，其中tetO相对丰度最高，为2.42×10-3~1.17×10-1，qnrB的相对丰度最低，为6.02×10-6~1.68×10-3，此外，sul1、sul2、strA和intI1在不同处理单元中的相对丰度的数量级没有变化。
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图 4 不同粪便处理单元中ARGs的相对丰度 Figure 4 The relative abundance of ARGs in different feces treatment units |
经过粪便处理工艺后，13种目标ARGs以及基因元件intI1的去除效果见表 4。结果表明，处理后的粪便与原始粪便相比，13种目标ARGs以及intI1的相对丰度普遍降低，只有tetX、sul1和sul2出现富集现象，其中tetX的富集现象最为明显，相对丰度的lg值升高了1.08，该工艺对其余4种四环素类ARGs有良好的去除效果，相对丰度（lg值）下降了1.57（tetL）~1.93（tetQ），此外该工艺对粪便中大环内酯类ermC和ermB的去除效果有较大差异，对ermC的去除效果优于ermB，基因元件intI1虽为正去除，但相对丰度（lg值）仅下降了0.04。GUO等[22]发现在猪粪堆肥后，其中四环素类ARGs和大环内酯类ARGs的丰度会降低，其中tetW和ermC的丰度减少90% 以上；TAO等[23]对猪场常温堆肥的研究发现，在完成堆肥后磺胺类sul1和sul2的丰度（lg值）上升1.11~2.49，ZHANG等[24]在研究猪粪堆肥样品时也得出了类似结果。
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表 4 猪场粪便中ARGs在各处理单元中的去除效果（lg值） Table 4 Table 4 Removal effect of ARGs in pig feces in each treatment units (lgs) |
经过处理工艺后，牛场粪便中ARGs相对丰度的变化如图 4（B）所示。在不同处理单元中，磺胺类sul1和sul2的相对丰度最高，为1.51×10-3~4.42×10-2，喹诺酮类qnrS、qnrB和oqxB的相对丰度最低，为1.68 × 10-6~3.21×10-5。同类型ARGs的相对丰度存在较大差异，四环素类tetX、tetW和tetL（10-4~10-3）的相对丰度高于tetO和tetQ（10-6~10-3），大环内酯类ermB（10-4~10-2）高于ermC（10-5~10-6），此外，链霉素类strA和基因元件intI1在整个粪便处理过程中相对丰度的数量级没有变化，分别为10-3和10-4。
牛场粪便中13种目标ARGs以及基因元件intI1的去除效果如表 5所示。通过比较两种处理手段下ARGs的去除效果发现，牛场粪便在经过堆肥处理后，13种ARGs中有9种的相对丰度（lg值）下降了0.02（oqxB）~3.05（tetQ）；4种的相对丰度（lg值）上升了0.01（sul1）~0.63（ermC）；intI1的相对丰度（lg值）下降了0.42。而粪便在经过无菌晾晒处理后，有5种ARGs的含量降低，相对丰度（lg值）下降了0.39（tetX）~2.52（ermB）；7种相对丰度（lg值）上升了0.06（ermC）~1.04（tetL）；intI1的相对丰度（lg值）升高了0.09，值得注意的是，牛粪在经过灭菌处理后，部分ARGs出现富集现象，其原因可能是高温灭菌处理（50~60 ℃）虽然可以消除部分致病菌，但是也可能会促进部分细菌增殖，从而造成耐药基因丰度升高。总体而言，相对于晾晒处理，堆肥处理可能对牛粪中ARGs有更好的去除效果。此外，在堆肥处理后，5种目标四环素类ARGs丰度降低趋势明显，lg值下降了0.35~3.05，这与DIEHL等[25]对牛场堆肥发酵的结果一致，表明堆肥发酵处理可能对大部分四环素类ARGs有较好的去除效果；磺胺类ARGs和喹诺酮类ARGs的去除效果不理想；大环内酯类ermB表现出正去除效果，相对丰度（lg值）下降了0.97，这与彭晶等[26]对牛粪堆肥后大环内酯类ARGs丰度变化的研究结果不一致，这可能与牛粪堆肥原料、堆肥环境以及微生物群落组成的差异有关。
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表 5 牛场粪便中ARGs在各处理单元中的去除效果（lg值） Table 5 Removal effect of ARGs in cattle feces in each treatment unit(lgs) |
随时间变化，好氧堆肥后鸡粪中ARGs相对丰度的变化规律及污染特征如图 4（C）所示。在13种ARGs中，喹诺酮类ARGs的含量最低，相对丰度为3.72×10-7~5.04×10-5，其余目标ARGs的相对丰度均在10-5以上，其中同类ARGs的含量也有差异，磺胺类的相对丰度sul2（10-4~10-2）高于sul1（10-4~10-3），大环内酯类的相对丰度ermB（10-4~10-2）高于ermC（10-4~ 10-3），此外基因元件intI1的相对丰度为4.14×10-5~ 7.21×10-4。
不同堆肥时间下，粪便中ARGs的相对丰度变化如表 6所示。在13种目标ARGs中，tetW、tetQ、tetO、qnrS、oqxB、ermB和strA的相对丰度（lg值）下降了0.27（oqxB）~2.85（tetO），而tetX、tetL、sul1、sul2和ermC出现富集现象，相对丰度（lg值）上升了0.03（tetX）~1.52（sul2），这说明堆肥可能成为了部分ARGs含量增加的良好反应器。就去除不同种类ARGs而言，好氧堆肥对四环素类ARGs的去除效果高于其余ARGs，其中tetW、tetQ和tetO的去除效果最好，相对丰度（lg值）下降了1.20~2.85；磺胺类sul1和sul2呈现负去除效果，相对丰度（lg值）上升了0.96和1.52；大环内酯类ARGs的去除效果有明显差异，其中ermC出现富集现象，相对丰度（lg值）升高了1.43，而ermB的相对丰度（lg值）下降了1.83。LI等[27]在对堆肥26 d后的鸡粪检测中发现，tetW和ermB等四环素类与大环内酯类ARGs的相对丰度降低，磺胺类sul1的相对丰度升高了7.5倍，与本试验ARGs的相对丰度的变化相似。此外，基因元件intI1的相对丰度（lg值）上升了1.24，SELVAM等[28]研究了高温条件下鸡粪堆肥后ARGs的变化，发现intI1明显增值，与本试验的结果一致。值得注意的是，不同堆肥时间，粪便中ARGs的相对丰度呈现波动式变化，第2 d，目标ARGs整体呈现下降趋势，第4 d ARGs整体出现富集现象，其中ermB的相对丰度升高最多，第8 d所有ARGs和intI1的相对丰度均下降，而第16 d ARGs以及intI1的相对丰度（lg值）上升了0.14~1.03。在堆肥过程中，ARGs的相对丰度出现上下波动现象，这可能是由于不同堆肥时期的微生物群落变化的原因[29]。
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表 6 鸡场粪便中ARGs在堆肥处理中的去除效果（lg值） Table 6 Removal effect of ARGs in chicken feces during composting（lgs） |
综上所述，3种养殖场处理工艺对畜禽粪便中ARGs的去除效果有较大差异，但总体对ARGs表现出良好的去除效果，均可以有效去除四环素类ARGs和大环内酯类ermB，但无法有效去除磺胺类ARGs和大环内酯类ermC。值得注意的是，猪场粪便在经过异位发酵床处理后，10种ARGs的相对丰度（lg值）平均下降了1.11；牛场粪便在堆肥后，9种ARGs的相对丰度（lg值）平均下降了0.83，在灭菌作垫料后，5种ARGs的相对丰度（lg值）平均下降了1.12；鸡场粪便堆肥后，8种ARGs的相对丰度（lg值）平均下降了1.32。
3 结论（1）畜禽养殖场粪便和污水中抗生素抗性基因普遍存在（10-7~10-1），但不同畜禽养殖场粪便中ARGs的污染程度存在差异，猪场污水中ARGs的污染水平普遍高于牛场。
（2）经过不同污水处理单元后，猪场和牛场对四环素类ARGs的去除效果相对较好，且相对于牛场，猪场污水处理工艺对ARGs有更强的去除效果；厌氧发酵单元、贮存池单元和调节池单元可能对ARGs去除起到较大作用。
（3）3种养殖场的粪便处理工艺对四环素类ARGs的去除效果较好，对磺胺类ARGs的去除效果较差。
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